Phân lập tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ @ 2” VÕ VĂN SONG TOÀN PHAN LAP, TUYEN CHON VI KHUAN TRONG DA CO DE UNG DUNG CHAN NUOI GIA SUC NHAI LAI VA CUNG CAP CHO QUA TRINH LEN MEN CON TU BA MiA LUẬN ÁN TIÊN SĨ NGÀNH VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 Cần Thơ, 2015 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ VÕ VĂN SONG TOÀN PHAN LAP, TUYEN CHON VI KHUAN TRONG DA CO DE UNG DUNG CHAN NUOI GIA SUC NHAI LAI VA CUNG CAP CHO QUA TRINH LEN MEN CON TU BA MiA LUAN AN TIEN SI NGANH VI SINH VAT HOC MA CHUYEN NGANH: 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học PGS. TRÀN NHÂN DŨNG PGS. HO QUANG DO Cần Thơ, 2015 TRANG XÁC NHAN CUA NGƯỜI HUONG DAN KHOA HQC Luận án “phân lập, tuyến chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía” do nghiên cứu sinh Võ Văn Song Toản thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Trần Nhân Dũng và PGS.

Luận án đã được nghiên cứu sinh nghiêm túc sửa chữa theo góp ý của hai (02) phản biện độc lập. Tác giả luận án Võ Văn Song Toàn Người hướng dẫn khoa học chính Người hướng dẫn khoa học phụ PGS. TS TRÀN NHÂN DŨNG PGS. HO QUANG DO LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thầy PGS.

Trần Nhân Dũng và thầy PGS. Hồ Quảng Đồ, người đã tận tình hướng dẫn khoa học, tư vấn thiết kế các thí nghiệm, hướng dẫn cách tiếp cận các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu từ đó giúp tôi hoàn thành luận án nghiên cứu sinh. Xin chân thành cảm ơn và tri ân sâu sắc đến hai thầy. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Khoa Sau Đại Học, Phòng Quản Lý Khoa Học và các phòng ban chức năng khác của Trường, Viện đã tạo điều kiện thuận lợi trong thực hiện các thủ tục, hỗ trợ kinh phí, trang thiết bị,.

cho các nghiên cứu của Luận án. Chân thành cảm ơn quý thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc Viện Nghiên cứu va Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Biện, anh Nguyễn Văn Hùng, anh Nguyễn Văn Việt và em Võ Phuong Ghil đã hỗ trợ kỹ thuật, chuyên môn trong việc chăm sóc, nuôi dưỡng bò đê trién khai các thí nghiém in vitro và in vivo. Đồng thời, tôi cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên đã cộng tác trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Sau cùng tôi xin được cảm ơn cha, mẹ, vợ, con và những người thân trong gia đình đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn. VÕ VĂN SONG TOÀN TÓM TÁT Đề tài luận án “Phân lập, tuyên chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía” đã được thực hiện trong thời gian 3 năm 9 tháng (11/2010 - 8/2014), nhằm mục tiêu ï) Tuyên chọn tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ (VKDC) ứng dụng trong chăn nuôi gia súc nhai lại và ii) Tuyên chọn tổ hợp VKDC-nấm men đề lên men ethanol từ nguyên liệu bã mía. Kết quả đã phân lập được 121 dòng VKDC trong đó tế bảo vi khuẩn có dạng que ngắn chiêm ưu thế bên cạnh tế bào que dài và hình cầu.

Qua quá trình tuyên chọn, tô hợp VKDC bò bao gồm 4 dòng VKDC trong đó dòng VKDC bò BMI3, được xác định đồng hình với Achromobacter xylosoxidans BL6 (China) ở mức 91% cùng với đặc điểm dạng que ngắn, Gram âm, dương tính catalase. Trong khi đó dòng VKDC bò BM2I, BM49 và VKDC dé DD9 tương đồng với Baeillws subtilis strain S20 (Cameroon), Uncultured Bacillus sp.171 va Bacillus subtilis RC24 6 mire 94% và đều có dạng que ngắn, Gram dương, catalase dương tính; Đồng thời enzym endoglucanse của 4 dòng vi khuẩn này được phát hiện có khối lượng phân tử trong khoảng 72,8 - 34 kDa trong khi enzym exoglucanase cia B. subziis ân BM2I có khối lượng phân tử trong khoảng 81,28 - 71,69 kDa. Viéc phối hợp VKDC bò (BMI3, BMA2I, BM49) với VKDC dê (DD9) theo tỷ lệ 1:3, kết quả bước đầu đã cho thấy tô hợp VKDC phân giải tốt bã mía trong điều kiện in viroø cũng như hỗ trợ tích cực cho bò thí nghiệm trong diéu kién in vivo voi ham Iugng NH, vat chat khé (VCK), cellulose, hemicellulose, lignin, protein tong (CP) được tiêu hóa tăng lên cũng như thức ăn dạng lớn giảm dần trong khi thức ăn dạng vừa và nhỏ tăng dần sau 4 đến 6 giờ cho ăn và kết quả là bò đã tăng trọng trung bình dat 0,517 kg/ngay.

Bên cạnh đó, phân tích ving gen ITS 1-4 dong nam men D11 cho két qua dinh danh tuong déng véi Candida inconspicua 6 mite 96%. Dong nam men DII bước đầu cũng đã cho thấy khả năng lên men ethanol từ sản phẩm đường hóa bã mía của tổ hợp VKDC bò (BM13, BM21, BM49) ở pH 6, nhiệt độ 30°C và thời gian lên men 7 ngày. Từ khóa: Bã mía, in yữro, ïn vivo, gia súc nhai lại, lên men ethanol, vỉ khuẩn dạ cỏ. ABSTRACT The thesis “Isolation and selection of rumen bacteria for applications in raising ruminants and alcohol fermentation from bagasse” was carried out in 3 years and 9 months (11/2010 — 8/2014), with the aims of i) Isolating bacterial consortium from rumen fluid for application in raising ruminants and ii) Selecting of yeast and the rumen bacteria for alcoholic fermentation from sugarcane bagasse.

In total of 121 bacterial strains were isolated from rumen fluid (RB); the majority was short rod-shape bacteria, whereas the minority was dominated by long rod-shape and cocci bacteria. After the selection, the bacterial consortium included three strain of cow RB (BM13, BM21, BM49) and one strain of goat RB (DD9). These strains were sequenced and the strain BM13 was determined to be isomophic with Achromobacter xylosoxidans BL6 (China) at 91% and included of characteristics: Short rod-shape, Gram negative and catalase positive. While, The other strains including of BM21, BM49 and DD9 were homologous with Bacillus subtilis strain S20 (Cameroon), Uncultured Bacillus sp.171, and Bacillus subtilis RC24 respectively at 94% with short rod-shape, Gram positive and catalase positive characteristics.

Simultaneously, endoglucanase purified from four these strain showed range of molecular weight 72. While molecular weight of exoglucanase purified from bacterium strain BM21 illustrated in a range from 81,28 — 71. Mixture of cow RB (BM13, BM21, BM49) and goat RB with ratio of 1:3, the results initially showed the consortium of RB was the potential for effectively hydrolysis of sugarcane bagasse in vitro as well as positive supporting for feed digestion of experimental cows in vivo, it was illustrated by the rising of NH; concentration, digested amount of dry matter (DM), cellulose, hemicellulose, lignin, total protein; it also caused reducing of large type feed and increasing of medium and small type feed after eating 4 to 6 hours and as a result, cows’ weight increased 0. Besides, the genetic analysis of ITS 1-4 of yeast strain D11 revealed that it was homologous with Candida inconspicua at 96%.

This strain initially showed the ability of alcoholic fermentation from saccharification products of the RB consortium (BM13, BM21, BM49) at pH 6, 30°C and 6 days. Key words: Ethanol fermentation, in vitro and in vivo rumen bacteria, ruminants, sugarcane baggasse. CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc CAM KET KET QUA Tôi xin cam kết luận án “Phân lập, tuyến chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía” này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Nhân Dũng và PGS.

Các kết quả của công trình nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nảo khác. Tác giả luận án Võ Văn Song Toàn MỤC LỤC 0/9099. TOM TAT ABSTRACT CAM KET KET QUA MUC LUC DANH SACH BANG DANH SACH HINH DANH MUC TU VIET TAT CHUONG I: GIOI THIEU TT Tính cấp thiết của 46 ti cesses nacscansacanarmaccenmmanann 1 1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu .1 Mục tiêu nghiên cứu 1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.5 Những đóng góp của luận án.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án.-- -- + 4 CHUONG II: TONG QUAN TAI LIEU 2-1 Tiêu Bóã:ở 18506 TNBÍ lãicccseceecocbiasiaseakoostaeaii 2.1 Cấu tạo bộ máy tiêu hóa.3 Tiêu hóa ở dạ tổ ong, dạ lá sách và dạ múi khê. Tiêu hóa ở ruột của gia súc nhai lai .5 Thành phần dưỡng chất trong dạ cỏ 2.6 Phương pháp đánh giá chất lượng thức ăn.2 Bã mía và enzym cellulase.

Một số phương pháp phân tích cellulase.3 Ethanol sinh học.1 Lên men ethanol sinh học 2.2 Cơ chế lên men ethanol.3 Lên men lignocelÏuÌO $e. Một số yêu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men.---5 30 2,4 'TìñNTñH'ñgHiệifCƯU tvyactáeeoaceviatitoaitAolUSi8300616059400630201020)0651948086 32 9:4:1Tình:Hìnlirighiôif cứu ngöãi TỨCcccccccceciioiuiokitobigkisdddlidogtddGoissigssascaal 32 iv 2:4:2'Tình Hình nghiên cứu töTiE HƯỚC:cceccecccecneEiRiiniiediiicEiEdtGGiitgggaEegHÔ 33 CHUONG III: NOI DUNG, PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU.1 Nội dung nghiên CUU Lo. cece eee ee cee cece +2 221 222 SH.2 Phương tiện nghiên cứu.2 Thiết bị thí Mfiyhiii.Phườơng pháp nghiÊñGỨU:.1 Nội dung 1: Phân lập và tuyên chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía mạnh từ dịch dạ cỏ trâu, bò, cừu và đÊ.2 Nội dung 2: Tuyển chọn tô hợp VKDC đê phân giải bã mía trong điều kién in vitro va in vivo.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của nâm men va VKDC trong quá trình lên men ethanol từ bã mía .4 Xử lý số liệu CHUONG IV: KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN.1 Thanh phan héa hoc ba mia .2 Phân lập và tuyên chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía mạnh từ dịch đạ cỏ bò, trâu, cừu và dê 4.1 Vi khuẩn dạ cỏ bò. uray terse ADD TH GAH DCO BF A exe szssasesercscereernssemceseemeccoantaceec sees cacoceaas sconce trees 68 4.3 Vi khuẩn dạ cỏ cừu 4.4 Vi khuân dạ cỏ đê.5 Phân tích quan hệ di truyền của VKDC.3 Tuyên chọn tô hợp dịch VKDC phân giải xơ trong điều kién in vitro va in vivo 98 4.1 Ảnh hưởng của các tổ hợp VKDC giữa các loài đến sự phân giải bã mía tföïE điều kiện Eí HHỮÔ tonnottggiGGGGSGIISRGGNSEERISSEStlotyarosegesamdi 98 4.2 Ảnh hưởng của VKDC bò và đê lên các chỉ tiêu khảo sát trong điều kiện TW bồ rrccriortrtirtibitdtbtititaä10i381,a0tể1ag801đ100t16a118-Sã0đ-c8SiagtAT8g8Gt3L2g14đ3i108.4 Tuyên chọn nắm men và VKDC để lên men ethanol từ bã mía.1 Tổ hợp các dong nam men va cac dong VKDC duge tuyén sews Ở bò.