Nguyễn Xuân Hoàng: Tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô mỡ thỏ và màng chân bì da người - Luận văn Thạc sĩ Y học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- NGUYỄN XUÂN HOÀNG TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ SỰ KẾT HỢP GIỮA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MỠ THỎ VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- NGUYỄN XUÂN HOÀNG TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ SỰ KẾT HỢP GIỮA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MỠ THỎ VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH (MÔ PHÔI) MÃ SỐ: 8720101 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. HUỲNH DUY THẢO 2. TRẦN NGUYỄN QUỐC VƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021.

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được sự hướng dẫn khoa học của TS. Huỳnh Duy Thảo và TS. Trần Nguyễn Quốc Vương. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực.

Những số liệu trong bảng biểu, đồ thị, hình ảnh phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính nhóm nghiên cứu của chúng tôi thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021 NGUYỄN XUÂN HOÀNG.

MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục đồ thị MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.1 Tổng quan về mô sụn.2 Quá trình sửa chữa tổn thương sụn .3 Các chiến lược điều trị trong phục hồi, sửa chữa tổn thương sụn khớp .1 Nhóm can thiệp điều trị không có thành phần sinh học .2 Nhóm can thiệp điều trị có thành phần sinh học .4 Kỹ nghệ mô trong sửa chữa và tái tạo mô sụn.1 Tổng quan và ứng dụng kỹ nghệ mô trong tái tạo mô sụn.2 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ .3 Giá thể màng chân bì .5 Tình hình nghiên cứu ngoài nước .6 Tình hình nghiên cứu trong nước. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Đối tượng nghiên cứu .2 Tiêu chuẩn chọn mẫu.3 Thiết kế nghiên cứu .5 Phương pháp nghiên cứu .1 Phân lập và định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ.2 Tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM và giá thể màng chân bì da người .3 Đánh giá tấm tế bào sụn. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .1 Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ .1 Kết quả phân lập, nuôi cấy tăng sinh TBGTM từ mô mỡ .2 Đánh giá sự tăng sinh của TBGTM từ mỡ .2 Kết quả định danh TBGTM từ mỡ.1 Khảo sát hình thái học và đặc tính bám dính .2 Khảo sát khả năng biệt hóa .3 Khảo sát biểu hiện gien bằng phương pháp PCR .4 Khảo sát biểu hiện gien cho các marker đặc trưng sụn bằng qRT-PCR.3 Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp TBGTM từ mô mỡ thỏ với màng chân bì .1 Kết quả đánh giá mô học .2 Kết quả chụp SEM .55 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ Viết Tắt Tiếng Anh ACI Autologous Chodrocyte Implementation ADSC Adipose Derived Stem Cell CS Cộng sự DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 EDTA Ethylene Diaminetetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum H&E Hematocylin & Eosin iPSCs Induced Pluripotent Stem Cells ISCT International Society for Cellular Therapy KHV Kính hiển vi MACI Membrane-asociated ACI PBS Phophate-Buffered Saline Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain qRT-PCR Reaction RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SEM Scanning Electron Microscopy TBGTM Tế Bào Gốc Trung Mô TEM Transmission Electron Microscopy TGF-1 Transforming growth factor-1. DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Tiêu chuẩn định danh TBGTM. Thành phần phản ứng RT-PCR.

Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR. Thành phầ khuếch đại các gien tạo sụn. Chu trình nhiệt phản ứng qRT-PCR. Mật độ tế bào thu nhận theo thời gian.

So sánh các marker bề mặt giữa người và thỏ bằng Flow cytometry giữa các nghiên cứu. So sánh các marker bề mặt bằng phương pháp RT-PCR giữa các nghiên cứu. Bảng số liệu mức độ biểu hiện gien theo thời gian. DANH MỤC HÌNH Hình 1.

Phân bố sụn trong cơ thể. Phân loại mô sụn. Các dạng tổn thương sụn .4 Lược đồ phương pháp ACI. Những tiến bộ trong kỹ nghệ mô.

Các thành phần chính của kỹ nghệ mô trong sửa chữa sụn. Các nguồn tế bào gốc, nguồn thu nhận và đặc điểm của chúng. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô. Quy trình phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mỡ.

Xử lý mẫu mô mỡ để thu nhận TBGTM. Một số loại môi trường được sử dụng để cảm ứng biệt hóa TBGTM thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ. Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ. Kết quả quan sát hình thái và đặc tính bám dính của TBGTM từ mô mỡ dưới KHV đảo ngược 10X.

Kết quả đánh giá khả năng biệt hóa của TBGTM. Kết quả RT-PCR của các marker TBGTM. Cấu trúc mô học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào sụn. Kết quả nhuộm mô học tấm tế bào sụn từ sự kết hợp của TBGTM mỡ và màng chân bì.

Cấu trúc mô học nhộm H&E của tấm tế bào sụn được đưa lên lần 2. Kết quả chụp tấm tế bào sụn bằng KHV điện tử quét (SEM). DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3. Đường cong tăng trưởng tế bào của TBGTM F3.2: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện tương đối của gien SOX9, COL2A1, COL10A1, RUNX2 bằng phương pháp Realtime-PCR.

MỞ ĐẦU Thoái hóa khớp gối là bệnh khá thường gặp. Trên thế giới có khoảng 263 triệu người mắc bệnh này [42] và khoảng 20 % người trưởng thành từ 45 tuổi ở Mỹ được chẩn đoán bằng X-Quang trong nghiên cứu Framinham [50]. Tại Việt Nam, tỷ lệ lưu hành bệnh thoái hóa khớp gối trên X-quang là 44,60 % ở người trên 40 tuổi [4]. Tuy nhiên, tỷ lệ thoái hóa khớp gối ở những người trẻ ngày càng gia tăng gây ảnh hưởng tới khả năng vận động cũng như giảm đáng kể chất lượng cuộc sống của người bệnh [11].

Các phương pháp điều trị bệnh hiện nay chủ yếu là điều trị triệu chứng. Trong những trường hợp tổn thương nặng hoặc điều trị nội khoa không hiệu quả thì phẫu thuật thay khớp thường được lựa chọn. Phẫu thuật thay khớp gối là một phẫu thuật lớn nên cũng đối mặt với những vấn đề gồm nhiễm khuẩn, mổ lại, tử vong và việc thay khớp gối nhân tạo cũng có hạn chế là tuổi thọ của mảnh ghép, đặc biệt trên những bệnh nhân trẻ tuổi [60], [10]. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau để điều trị nhằm làm chậm, phục hồi và kéo dài thời gian thay khớp tùy vào mức độ tổn thương bề mặt sụn khớp như tiêm nội khớp, kích thích mọc sụn bằng tạo tổn thương dưới sụn có hoặc không kết hợp với ghép sụn xương.

Trong các chiến lược phục hồi, sửa chữa tổn thương sụn khớp thì kỹ nghệ mô là một cách tiếp cận hiện đại và có tiềm năng khắc phục những nhược điểm của các phương pháp điều trị truyền thống. Kỹ nghệ mô sụn có thể kết hợp một trong ba thành phần quan trọng gồm tế bào, giá thể và yếu tố sinh học để có thể tái tạo, sửa chữa hoặc tạo ra mô sụn giống với sụn bình thường để có thể ứng dụng trong ghép sụn [32]. Đối với yếu tố tế bào trong kỹ nghệ mô sụn thì tế bào gốc là một trong những ứng viên tuyệt vời để sử dụng vì chúng có những đặc điểm mà các tế bào khác không có đó là khả năng tăng sinh và tiềm năng biệt hóa. Trong số các loại tế bào gốc được quan tâm thì tế bào gốc trung mô là một trong những loại tế bào được ưu tiên lựa chọn hàng đầu [23], [32].

Tế bào gốc trung mô là những tế bào gốc đa tiềm năng, có thể biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau kể cả tế bào sụn, do đó có thể sử dụng các tế bào gốc này để tái tạo và thay thế các tế bào sụn bị tổn thương trên người bệnh. Chúng có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như mô mỡ, tủy xương, máu ngoại vi…Đặc biệt là sự xuất hiện của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ. Đây là nguồn tế bào có nguồn cung cấp dồi dào, ít bị hạn chế về mặt đạo đức trong nghiên cứu, dễ thu nhận, số lượng tế bào gốc trung mô trong mô mỡ cao hơn so với thu nhận từ các nguồn mẫu khác như tủy xương, máu ngoại vi [14], [15]. Ngoài ra chúng còn có khả năng ức chế miễn dịch và chống viêm [23], [32].

Bên cạnh đó, giá thể hay khung nâng đỡ trong kỹ nghệ mô cũng là một trong ba yếu tố vô cùng quan trọng. Việc lựa chọn giá thể phù hợp sẽ hỗ trợ và tạo điều kiện cho tế bào tăng sinh, biệt hóa thành mô chức năng và làm tăng khả năng phục hồi tổn thương sụn [63], [66] cũng như cải thiện lâm sàng [35]. Trong số đó, giá thể collagen thuộc nhóm giá thể sinh học có nguồn gốc tự nhiên thường được sử dụng trong kỹ nghệ mô sụn vì khả năng tương thích sinh học cao, khả năng thoái biến sinh học tốt, gây phản ứng miễn dịch thấp, cấu trúc xốp, tính thấm tốt, giúp tế bào bám dính, di cư và biệt hóa tế bào [27], [29], [41]. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu lựa chọn màng chân bì làm giá thể để tạo ra mảnh ghép.

Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu ban đầu về tiềm năng sử dụng tế bào gốc trung mô trong điều trị bệnh thoái hóa khớp gối [10], [89], [90]. Kết quả nghiên cứu cho thấy tiêm trực tiếp tế bào gốc trung mô giúp cải thiện triệu chứng và chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên, các nghiên cứu thử nghiệm đối với những trường hợp thoái hóa khớp chưa có nhiều, cũng như chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá được sự tái tạo lại bề mặt sụn khớp từ việc ứng dụng tế bào gốc trung mô.