Nghiên cứu methyl hóa promoter gen GSTP1 trong ung thư tuyến tiền liệt tại Đại học Khoa học Tự nhiên HN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Vƣơng Diệu Linh NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GEN GSTP1 TRONG QUÁ SẢN LÀNH TÍNH VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Vƣơng Diệu Linh NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GEN GSTP1 TRONG QUÁ SẢN LÀNH TÍNH VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu, cộng tác với các cộng sự khác, là sản phẩm của đề tài KC.05/11-15; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng nhƣ các hội nghị trong nƣớc và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại trong luận án chƣa đƣợc tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà nội, ngày tháng 4 năm 2018 Nghiên cứu sinh Vƣơng Diệu Linh LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Võ Thị Thương Lan, Khoa Sinh học, Đai học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án.

Cô không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận án, là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Tạ Bích Thuận.

Cô đã luôn động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc tôi gặp khó khăn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ đã cấp kinh phí cho đề tài KC.05/11-15 hỗ trợ cho nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y, Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và các đồng nghiệp Trung tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua.

Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp tôi hoàn thành tốt luận án này. Nghiên cứu sinh Vương Diệu Linh MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT. 4 DANH MỤC CÁC HÌNH. 8 DANH MỤC CÁC BẢNG.

Thực trạng ung thƣ. Cơ sở tế bào học ung thƣ. Di truyền học ung thƣ. Di truyền ngoại gen và ung thƣ.

Di truyền ngoại gen. Biến đổi histone trong ung thƣ. Methyl hóa DNA bất thƣờng trong ung thƣ. Ung thƣ tuyến tiền liệt.

Phân độ trong ung thƣ tuyến tiền liệt. Methyl hóa DNA trong ung thƣ tuyến tiền liệt. Cấu trúc và chức năng gen GSTP1. Phƣơng pháp phân tích methyl hóa DNA.

Phƣơng pháp COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis). Phƣơng pháp PCR đặc hiệu methyl MS-PCR (Methylation specific Polymerase chain reaction). Phƣơng pháp định lƣợng qMS-PCR. Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng bệnh ung thƣ.

Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thƣ. Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thƣ tuyến tiền liệt. Triển vọng của các bộ kit sử dụng dấu chuẩn methyl hóa DNA. Nghiên cứu methyl hóa DNA trong ung thƣ ở Việt Nam.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Mẫu nghiên cứu. Thiết bị chính. Phƣơng pháp nghiên cứu.

Chuẩn bị mẫu để tách chiết DNA. Nuôi cấy dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3. Tách chiết DNA tổng số. Xử lý DNA tổng số với bisulfite.

Phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp lai điểm. Phƣơng pháp điện di. Xác định nồng độ DNA bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ.

Tinh sạch sản phẩm PCR. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MS-PCR. Xác định số bản copy. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Thu thập và phân loại mẫu. Tách chiết DNA tổng số. Tách chiết DNA từ mẫu máu và dòng tế bào nuôi cấy PC3.

Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin. Xử lý DNA tổng số với bisulfite. Xây dựng phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng DNA sau xử lý bisulfite. Xử lý DNA tổng số của các mẫu bệnh phẩm với bisulfite.

Tối ƣu phản ứng MS-PCR để phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1. Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa. Kiểm tra sản phẩm đặc hiệu bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn. Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu bằng giải trình tự.

Xác định methyl hóa promoter gen GSTP1 ở các mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt và quá sản lành tính. Xác định ngƣỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 của phản ứng MS- PCR. Phân tích tình trạng methyl hóa của promoter gen GSTP1 và các đặc điểm lâm sàng. Xây dựng qui trình lai điểm (dot blot) để tăng độ nhạy và độ chính xác phát hiện sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa từ phản ứng MS-PCR.1 Đánh dấu đầu dò với biotin.

Tối ƣu điều kiện lai điểm. Xác định tính đặc hiệu của kỹ thuật lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa và không methyl hóa. Xác định ngƣỡng phát hiện của kỹ thuật lai điểm. Xác định sản phẩm MS-PCR có GSTP1 bị methyl hóa từ các mẫu ung thƣ tuyến tiền liệt và mẫu quá sản lành tính.

98 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 114 3 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ A260 Độ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm A280 Độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ) AMACR Alpha-Methylacyl CoA Racemase AP-1 Activator Protein - 1 APC Adenomatous polyposis of the colon gene Apoptosis Chết theo chƣơng trình AUC Area under the ROC curve bp Base pair BHV-4 Bovine Herpesvirus - 4 BRCA1/2 Breast cancer susceptibility gene BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò) BstUI Enzym giới hạn BstUI C-onc Cellular oncogenes CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A gene (p16(INK4a)) COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis CRBP1 Cellular retinol-binding protein-1 CRISP-3 Cysteine-rich secretory protein 3 cs. Cộng sự Da Dalton DNA Acid deoxyribonucleic DNMTs DNA methyltransferase dNTP Deoxynucleotide triphosphate DRE Digital Rectal Exam (Thăm khám qua trực tràng) dTTP Deoxythymidine triphosphate 4 dUTP Deoxyuridine triphosphate EcoRI Enzym giới hạn EcoRI EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen) FFPE Formalin fixed paraffin embedded GIST Gastrointestinal Stromal Tumor (U mô đệm dạ dày - ruột) GSH Glutathione GSPT1 Glutathione S-transferase Pi 1 gene GSTs Glutathione S-transferase GTP Guanosine Triphosphate H&E Haematoxylin & Eosin HATs Histone acetyltransferase HDACs Histone deacetylase HDMs Histone demethylase HIC1 Hypermethylated in cancer 1 gene HMTs Histone methyltransferase hTERT Humans Telomerase Reverse Transcriptase Gene International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên IARC cứu ung thƣ thế giới) JMJD3 Jumonji domain-containing protein 3 gene JNK c-Jun N-terminal kinase kb Kilobase = 1000 bp v-kit Hardy-Zuckerman 4 filine sarcoma viral oncogene KIT homolog LB Luria-Bertani (môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn) LSD1 Lysine specific demethylase 1A MDR Multidrug resistance gene MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene MLH1 MutL homolog 1 gene MS-DBA Methyl specific dot blot assay (Lai điểm đặc hiệu methyl) 5 MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl) PBS Phosphate Buffer Saline PC3 Prostate cancer cell lines (Dòng tế bào nuôi cấy) PCA3 prostate cancer antigen 3 gene Platelet – Derived Growth Factor (yếu tố tăng trƣởng có nguồn PDGF gốc tiểu cầu) PDGFRA Platelet-derived growth factor alpha gene PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone) PSA Prostate Specific Antigen (Kháng thể đặc hiệu tuyến tiền liệt) PSMA Prostate-specific membrane antigen RASSF1A Ras association domain family 1A gene Rb1 Retinoblastoma 1 gene ROC Receiver Operating Characteristic RTK Receptor Tyrosine Kinase SA-AP Streptavidin - Alkaline Phosphatase SAT2, D424, Trình tự DNA lặp lại NBL2 SDS Sodium Dodecyl Sulfate SEPT9 Septin 9 gene SHOX2 Short stature homeobox 2 gene SP1 Specificity Protein 1 SSC Saline Sodium Citrate SYBR Syber Green (thuốc nhuộm DNA) TAE Tris-acetate-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene UTX ubiquitously-transcribed TPR gene on the X chromosome UV Tia tử ngoại VHL Von Hippel-Lindau gene 6 V-onc Viral Oncogenes WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới) 7 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sáu đặc trƣng cơ bản của ung thƣ 18 Hình 1.2 Các dạng điển hình theo phân độ Gleason 27 Hình 1.3 Cấu trúc gen GSTP1 30 Hình 1.4 Nguyên tắc của phƣơng pháp COBRA 32 Hình 1.5 Phƣơng pháp MS-PCR khuếch đại DNA sau xử lý bisulfite 34 với các cặp mồi đặc hiệu cho DNA methyl hóa và DNA không methyl hóa Hình 1.6 Phƣơng pháp MethyLight sử dụng đầu dò Taqman và các 35 mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu cho DNA bị methyl hóa hoặc DNA không methyl hóa hoặc DNA không chứa cytosine trong trình tự Hình 1.7 Kỹ thuật HeavyLight sử dụng các chuỗi oligonucleotide 36 blocker (đoạn màu đen) liên kết với DNA không bị methyl hóa, ngăn cản các mồi gắn vào khuôn, dẫn tới không khuếch đại DNA không methyl hóa.

Ngƣợc lại, chuỗi này không bám đƣợc vào DNA bị methyl hóa nên các mồi và đầu dò Taqman khuếch đại đƣợc DNA bị methyl hóa Hình 1.8 Dấu chuẩn sinh học cho phép xác định những thay đổi ở 37 cấp độ nhiễm sắc thể, thay đổi trình tự nucleotide, biến đổi di truyền ngoại gen, biểu hiện RNA và sản phẩm protein Hình 2.1 Đầu dò GSTP đƣợc thiết kế dựa trên trình tự GSTP1 bị 44 methyl hóa đã tách dòng trong plasmid tái tổ hợp pG-Me Hình 2.2 (A) Các bƣớc xử lý bisulfite. (B) Kết quả minh họa DNA 49 bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa sau khi xử lý với bisulfite: MeC – Cytosine bị methyl hóa đƣợc giữ nguyên là C; C không bị methyl hóa biến đổi thành U Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 60 Hình 3.