Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc tại ĐH Y Dược TP.HCM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN MINH GIANG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ NGÀNH: HỒI SỨC CẤP CỨU VÀ CHỐNG ĐỘC MÃ SỐ: 62720122 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TRẦN VĂN NGỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án Trần Minh Giang luan an MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Bảng từ viết tắt và đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ, sơ đồ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tỉ lệ mới mắc của viêm phổi thở máy.

Tỉ lệ tử vong. Các yếu tố nguy cơ. Thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn phân lập được từ VPTM. Ứng dụng sinh học phân tử trong phát hiện gene kháng thuốc.

30 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết kế nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Cỡ mẫu và công thức tính cỡ mẫu. Tiêu chuẩn chọn mẫu. Phương pháp tiến hành.

Phương pháp phát hiện gene kháng thuốc……………………………………. Thu thập số liệu và phân tích dữ liệu. Đạo đức trong nghiên cứu……………………………………………………46 2. Liệt kê và định nghĩa các biến số (phụ lục 11) .47 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Đặc điểm chung. Định danh vi khuẩn dựa trên vi sinh kinh điển. Định danh vi khuẩn dựa trên giải trình tự gene 16S-rRNA. Tổng số loài vi khuẩn phát hiện được trên từng mẫu dịch rửa phế quản phế nang.

So sánh giữa giải trình tự gene 16S-rRNA và vi sinh kinh điển trong định danh vi khuẩn. Tính độ nhạy và độ đặc hiệu của PGM. Thời gian nằm ICU và tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy. Kết quả kháng sinh đồ.

Kết quả kháng sinh đồ MIC dựa trên E-test. Kết quả PCR tìm gene kháng thuốc. Kết quả điều trị. 75 Chương 4: BÀN LUẬN.

Định danh vi khuẩn. Kết quả kháng sinh đồ. Xác định gene kháng thuốc và mối liên quan với đề kháng kháng sinh. 108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC luan an BẢNG VIẾT TẮT VÀ ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt APACHE Acute Physiology and Chronic Thang điểm lượng giá bệnh Health Evaluation lý cấp tính và mạn tính ARDS Acute Respiratory Distress Hội chứng nguy ngập hô hấp Syndrome cấp ATS American Thoracic Society Hội Lồng Ngực Hoa Kỳ BA Blood agar Đĩa thạch máu BAL Bronchial-alveolar lavage Rửa phế quản phế nang BN Bệnh nhân Bp Base pair Cặp base BVCR Bệnh viện Chợ Rẫy BVNDGĐ Bệnh viện Nhân Dân Gia Định CAHI Chocolate agar Haemophilus Thạch chocolate cho influenzae Haemophilus influenzae CDC Centers for Disease Control and Trung tâm kiểm soát bệnh Prevention tật Hoa Kỳ CFU Colony-Forming Unit Đơn vị tạo khuẩn lạc CMV Cytomegalovirus Virus cytomegalovirus COPD Chronic Obstructive Pulmonary Bệnh phổi tắc nghẽn mạn Disease tính CPIS Clinical pulmonory infection score Thang điểm viêm phổi lâm sàng CRP C - reactive protein Protein C phản ứng DRPQPN Dịch rửa phế quản phế nang EBM Eosin methylene blue agar Thạch eosin methylene blue EPIC The European Prevalence of Tỉ lệ hiện mắc của nhiễm Infection in Intensive Care khuẩn ICU trên bệnh nhân Châu Âu ESBL Extended-Spectrum Beta- Men β-lactamase phổ rộng Lactamase luan an Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt FiO2 Fraction of inspired oxygene Phân suất oxy khí thở vào HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở người ICU Intensive care unit Khoa săn sóc đặc biệt IDSA Infectious Diseases Society of Hội bệnh lý truyền nhiễm America Hoa Kỳ IQR Interquartile range Khoảng tứ phân vị IVAC Infection-related ventilator - Biến chứng liên quan nhiễm associated complication khuẩn trên bệnh nhân thở máy KIA Kligler iron agar Thạch kligler iron KSĐ Kháng sinh đồ KTC Confidence interval Khoảng tin cậy MA MacKonkey agar Thạch MacKonkey MH Mueller Hinton agar Thạch Mueller Hinton MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MICU Medical intensive care unit Khoa ICU nội MRSA Methycillin-Resistant Tụ cầu vàng kháng Staphylococcus aureus methycillin MSSA Methycillin-Sensitive Tụ cầu vàng nhạy Staphylococcus aureus methycillin NC Nghiên cứu NCBI National center for biotechnology Trung tâm quốc gia về thông information tin công nghệ sinh học Hoa Kỳ NGS Next generation sequencing Giải trình tự thế hệ mới NKQ Nội khí quản NNIS National Nosocomial Infections Hệ thống khảo sát nhiễm Surveillance System khuẩn bệnh viện quốc gia Hoa Kỳ NSPQ Nội soi phế quản NTNT Ngưng tim ngưng thở luan an Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt OR Odds ratio Tỷ số số chênh PCT Procalcitonin Procalcitonin PEEP Positive end-expiratory pressure Áp lực dương cuối thì thở ra PGM Personal genome machine Máy bộ gene cá thể PK/PD pharmacokinetic/pharmacodynamic Dược động/dược lực Possible possible ventilator - associated Có thể viêm phổi thở máy VAP pneumonia PPI Proton pump inhibitors Ức chế bơm proton Probable Probable ventilator - associated Có thể có khả năng viêm VAP pneumonia phổi thở máy PSB Protected Specimen Brush Chải phế quản có nòng bảo vệ RR Risk ratio Tỷ số nguy cơ SaO2 Arterial oxygene Saturation Độ bảo hòa oxy động mạch SICU Surgical intensive care unit Khoa hồi sức ngoại SpO2 Pulse oximetric saturation Độ bão hòa oxy theo mạch đập SSĐB Săn sóc đặc biệt TBMMN Tai biến mạch máu não THA Tăng huyết áp T0 Nhiệt độ VAC Ventilator - associated condition Biến chứng liên quan thở máy VAE Ventilator-associated event Biến cố liên quan thở máy VK Vi khuẩn VP Viêm phổi VPTM Viêm phổi thở máy luan an DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

Tử suất thô theo điều trị kháng sinh ban đầu:……………………………. Bệnh nguyên của viêm phổi thở máy:……………………………………8 Bảng 1. Tần suất vi khuẩn phân lập được từ ICU bệnh viện Fatmawati:………. Tần suất vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân viêm phổi tại các khoa ICU ở Việt Nam:…………………………………………………………….

Tác nhân vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân thở máy tại ICU bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh:………………………. Tác nhân vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân thở máy tại ICU bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh (tiếp theo):……………. Tính đa dạng của vi khuẩn phát hiện được bằng giải trình tự gene:……. Các yếu tố nguy cơ của VPTM:……………………………………….

Thành phần phản ứng tạo các amplicon - phản ứng tạo “bản sao” các vùng V3, V6, V7 và V9 trong gen 16S-rRNA:………………………………38 Bảng 2. Thành phần hóa chất thêm vào dung dịch rửa trong việc tinh sạch phản ứng PCR khuếch đại các vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene 16S-rRNA:…. Thành phần phản ứng tạo amplicon hoàn chỉnh - tạo “đầu bằng” cho các bản sao của vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene 16S-rRNA:………………. Thành phần phản ứng tạo “thư viện” - phản ứng gắn Adapter và trP1 vào 2 đầu các bản sao “đầu bằng” của vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene 16S- rRNA:……………………………………………………………………….

Thành phần phản ứng tạo “bản sao” của các thư viện:…………. Thành phần dung dịch sử dụng cho việc gắn “thư viện” gene vào hạt ISP: ……………………………………………………………………………………. Thành phần phản ứng chuẩn bị gắn “thư viện” gene vào hạt ISP:……. Thành phần phản ứng tách mạch “thư viện” gene khỏi bản sao đã gắn trên hạt SP:….

Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nghiên cứu:……………………….49 luan an Bảng 3. Phân bố vi khuẩn phân lập được bằng định danh truyền thống:………. So sánh hai phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nuôi cấy và giải trình tự trên hệ thống PGM:………………. Độ nhạy và độ đặc hiệu của PGM:………………………………….

Kết quả kháng sinh đồ khuếch tán chung:………………………………60 Bảng 3. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Acinetobacter spp:…………………. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Klebsiella spp:…. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Pseudomonas spp:………………….

Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Acinetobacter baumannii:………. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với K. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Pseudomonas aeruginosa:………68 Bảng 3. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Escherichia coli:……………….

Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Burkholderia cepacia:…………. Phân bố gene kháng thuốc phát hiện được:……………………………73 Bảng 3. Mối liên quan giữa gene kháng thuốc và đề kháng kháng sinh:………. Kết quả người bệnh ra khỏi khoa chung:………………………………75 Bảng 3.

Kết quả điều trị:……………………………………………………….75 luan an DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Sơ đồ 2. Sơ đồ tạo thư viện cho kỹ thuật NGS:…………………………. Sơ đồ nghiên cứu:………………………………………………………47 Biểu đồ 3. Phân tích cụm trên 99 loài vi khuẩn định danh bằng giải trình tự 16S- rRNA:………………………………………………………………………………53 Biểu đồ 3.

Số loài vi khuẩn phát hiện được trên từng mẫu DRPQPN: …………. Mối liên quan giữa vi khuẩn phân lập được và số ngày nằm ICU:…. Mạng lưới của đa kháng kháng sinh đối với A. Tỉ lệ số kháng sinh bị đề kháng:…………………………………….72 luan an 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề lâm sàng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới vì tần suất mắc bệnh và tử vong tăng cao.

Tại Canada, VPTM là 18 ca trên 1000 ngày thở máy [75]. Các quốc gia Á Châu VPTM là 18% [43]. Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% - 52%, [2], [5], [7], [8], [11], [16], [17]. VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% - 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày ở nhóm có và không VPTM) và tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần) [5], [41].

VPTM được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Chẩn đoán VPTM được thiết lập dựa trên chứng cứ lâm sàng và vi sinh. Việc xác định vi khuẩn (VK) gây bệnh thông qua cấy định lượng hoặc bán định lượng đàm hút qua nội khí quản đơn thuần hoặc qua nội soi phế quản [34], [41], [50]. Việc định danh VK bằng nhuộm Gram, nuôi cấy, đặc tính mọc và các phản ứng sinh hóa là chuẩn mực.

Tuy nhiên phương pháp vi sinh kinh điển này không thể áp dụng trong các trường hợp sau: VK Gram âm khó mọc, mọc chậm; VK hiếm hoặc chỉ biểu hiện một vài đặc tính về sinh hóa. Cũng như các VK yếm khí, VK không cấy được và bệnh lý nhiễm khuẩn có kết quả cấy âm tính, nhất là trên bệnh nhân (BN) sử dụng kháng sinh trước đó [50], [57], [73], [74], [83], [97], [114]. Chẩn đoán phân tử, ngày nay, đã trở thành phương pháp tham chiếu để chẩn đoán vi sinh học của nhiều bệnh lý hô hấp [73]. Vai trò của giải trình tự gene 16S - rRNA trong định danh VK càng được chứng tỏ và được áp dụng rộng rãi trên lâm sàng [57], [58], [80], [116], [117].