Luận án tiến sĩ sinh học: Biến đổi gen ty thể ở bệnh ung thư đại trực tràng - Trường ĐH Khoa học Tự nhiên HN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thị Bích NGHIEN CUU BIEN DOI CUA MOT SO GEN TY THE O BENH UNG THU DAI TRUC TRANG LUAN AN TIEN Si SINH HOC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thị Bích NGHIEN CUU BIEN DOI CUA MOT SO GEN TY THE O BENH UNG THU DAI TRUC TRANG Chuyén nganh: Sinh ly học người và động vật Mã số: 62420104 LUẬN ÁN TIỀN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trịnh Hồng Thái 2. Tô Thanh Thúy Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu tôi đã thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.Trịnh Hồng Thái và TS.Tô Thanh Thúy cũng như sự hỗ trợ, giúp đỡ của các đồng nghiệp. Các số liệu, kết quả của luận án là trung thực, một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí khoa học.

Việc sử dụng các dữ liệu trong luận án của tôi đã được sự chấp thuận bằng văn bản của các đồng tác giả. Luận án chưa từng được tác giả khác công bó. Nghiên cứu sinh Phạm Thị Bích LOI CAM ON Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.Trịnh Hồng Thái và TS.Tô Thanh Thúy những người thầy/cô đã luôn tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ, định hướng và chỉ bảo cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cám ơn các bác sĩ, y tá Khoa Giải phẫu bệnh — Tế bào, Bệnh viện K Hà Nội, Bệnh viện Quân Y 103, các bác sĩ, y ta Khoa Sang loc mau, Vién Huyết học và Truyền máu Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp mẫu nghiên cứu cũng như thông tin về đặc điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thê Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành các thủ tục bảo vệ. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp và các bạn sinh viên Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã luôn hỗ trợ giúp đỡ trong quá trình tôi làm thực nghiệm và sử lý số liệu kết quả. Luận án đã được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của các dé tài KC.05 và trang thết bị, cơ sở vật chất của phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Pro- tein, Phòng thí nghiệm Sinh học người thuộc Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và người thân đã luôn tạo điều kiện tốt nhất đề tôi hoàn thành luận án. Pham Thi Bich MỤC LỤC 0006960975777.ÔỎ 1 DANH MỤC CÁC KY HIEU VA CHU VIET TAT. TÖÔNG QUAN TÀI LIỆỆU.UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG. Thực trạng mắc ung thư đại trực tràng.

Các yếu tố nguy cơ gây ung thư đại trực trằng. Một số đặc điểm bệnh học phản ánh tiến triển của ung thư đại trực tràng. Các chỉ thị sinh học của ung thư đại trực tràng. HỆ GEN TY THẺ VÀ HIỆN TƯỢNG DỊ TẾ BÀO CHÁ -„ 16 1.

Hệ gen ty thể và chức năng. Hiện tượng dỊ tế bào chất và ngưỡng biểu hiện của đột biến ADN ty thê. ĐỘT BIẾN ADN TY THẺ VÀ BỆNH UNG THƯ. Biến đổi của một số gen ty thê mã hóa cho các protein.

Biến đổi trên gen NDI. Bién G6: trén gen NDB vescecscecscssssscsssssessseessesssesssssssesssssesssesssesssessessseesseesseenee 1. Một số biến đổi ctia gen COX-1 Va COX-2 ceveesessvssssesssesssesssesssessessseesseesseenes 21 1.Mat doan dn trén ADN ty thé. Su thay déi sé ban sao ADN ty thé và bệnh ung thurs 1.

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THẺ Ở VIỆT NAM. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BIẾN ĐỎI GEN TY THẺ 1. Kỹ thuật PCR kết hợp với RELP. Xác định trình tự Ø€In.- 6 «x1 Tnhh TT TH HT Hàn Hiệp 1.

Các phương pháp định lượng mức độ biến đổi ADN ty thỂ. - ccccccccecrcee CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU “ "mm (0030300. Mẫu nghiên cứu.

MÁY VÀ TRANG THIẾT B].-s°-s°s£+se+S22se©2vzsetevsseevzssserre 33 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thư đại trực tràng. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu 2.

Điện di trên gel agarose và gel polyacryÏaimide. Nhân bản đoạn gen ty thể chứa đột biến quan tâm bằng kỹ thuật PCR. Kỹ thuật PCR và đa hình chiều dài các đoạn cắt giới han (PCR-RFLP). Nhân đòng trực tiếp đoạn gen chứa đột biến vào vector pJET1.

Giải trình tự các đoạn gen chứa đột biẾn,. ST Tt 2E 111011 1121111101111 xe. Tỉnh sach san pham PCR. Định lượng mức độ mất đoạn, số bản sao ADN ty thỂ.

CAC PHAN MEM TIN SINH HỌC, PHƯƠNG PHÁP THONG KE ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU. se s<s<zsee2zssecze 46 CHƯƠNG 3. KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN. BIẾN ĐỎI CỦA CÁC GEN ND1, ND3, COX-1 VÀ COX-2 TY THẺ.

Biến đổi T4216C và A4164G của gen WDI ry thể. Biến đổi A4164G và một số biến đổi khác. Tân suất biến đổi A4164G và mối liên quan với các đặc điểm bệnh học. Biến đổi A10398G thuộc gen W3 /y thể.

Một số vị trí biến đổi của gen COX-1 và COX-2 ty thê. MAT DOAN LON CUA ADN TY THE O BENH NHÂN UNG THU DAI TRUC TRANG. Xác định mất đoạn 4977 bp và một số mất đoạn lớn khác. Xác định mắt đoạn 4977 bp.s-©cs St CkEEEE 2111121111111 eree 65 3.

Xác định các mắt đoạn lớn khác 4977 bịp. Mối liên quan giữa tỷ lệ mất đoạn 4977 bp với các đặc điểm bệnh học. Xác định mức độ mắt đoạn lớn của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng bằng phương pháp real-time PCR. Xây dựng đường chuẩn cho kỹ thuật real-time PCR xác định mức độ mắt đoạn lớn của ADN ty thể.

Xác định mức độ mắt đoạn trên các mẫu nghiÊH CỨU. Mối liên quan giữa mức độ mất đoạn lớn với các đặc điểm bệnh học. SỰ THAY ĐỎI SỐ BẢN SAO ADN TY THẺ Ở CÁC BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG. Số bản sao ADN ty thể ở các mẫu nghiên cứu.

Mối liên quan giữa số bản sao ADN ty thê với các đặc điểm bệnh học. TAC DONG TONG HOP CUA MOT SO BIEN DOI, MUC DO MAT DOAN, SÓ BẢN SAO CỦA ADN TY THẺ VỚI TIỀN TRIÊN UTĐTT. Đối với sự di căn hạch. Đối với sự tiến triển giai đoạn ung thư 3.

VAI TRÒ CỦA MÁT ĐOẠN, SỐ BẢN SAO VỚI NGUY CƠ MẮC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG. Mối tương quan về mức độ mắt đoạn, số bản sao ADN ty thể giữa mẫu mô và mẫu máu, giữa mức độ mất đoạn và số bản sao ADN ty thỂ. Mức độ mắt đoạn tăng làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực trằng.,Ô 100 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN 0n 9 -. TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1.

Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng. Vị trí và chức năng của các gen ty thỂ.-------s¿©ccse+cxevcrscee -2- PHU LUC 3. Danh sach, dac diém bénh hoc va nong độ ADN tổng số từ các mẫu của bệnh nhân ung thư đại trực trằng.- --- ‹ 6 xxx HT nh ng ng rưy -3- PHỤ LỤC 4. Ảnh điện di ADN tổng số từ một số mẫu nghiên cứu.

Bản cam kết cho mẫu của bệnh nhân. Phiếu lẫy mẫu ung thư .-- 2:22 22+2+22EtSEEEtSExerrrkeerrerrrks -1l1- PHỤ LỤC 7. So sánh trình tự đoạn ADN của gen VD!, ND4, HBB với trình tự ADN ty thể chuẩn, gen HBB bằng chương trình BLAST. Một số biến đổi, mất đoạn 4977 bp, mức độ mắt đoạn, số bản sao ADN ty thể của mô ung thư đại trực tràng.-22:©25222sScxeccrxeerrkeerreesres -13- PHỤ LỤC 9.

Kết quả real-time PCR, đồ thị của hai đường chuân NDI va ND4. Mức độ mắt đoạn, số bản sao ADN ty thể của 40 bệnh nhân UTĐTT từ Bệnh viện Quân Y 103 PHỤ LỤC 11. Dự đoán khả năng mắc UTĐTT dựa vào mức độ mắt đoạn từ phân tích hồi quy đơn biến. ¿2-2 ©22+SEE+EEEEEE2EEEEE1171117112712271.

21121 cxeE -24- PHỤ LỤC 12. Dự đoán khả năng mắc UTĐTT dựa vào số bản sao ADN ty thé va mat doan tir phan tich héi quy đơn biến PHU LUC 13. Méi lién quan giữa mức độ mật đoạn, sô bản sao ADN ty thể với các đặc điểm bệnh học của bệnh UTĐTTT.- 2: 5c ©Sẻ+ ++EE£EE£EEEEEESEEEEEEEEEEErrrerrrrk - 30 - AJCC ATP bp COX-I COX-2 Cytc D-loop EtBr GD HPLC KSS LHON LCU MELAS mtADN NADH NDI ND3 OXPHOS PCR RFLP ROS TNM UTĐTT Tm DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TAT American Joint Committee on Cancer (hiệp hội ung thư Hoa Ky) Adenosine triphosphate Base pair (cap bazo) Cytochrome c oxidase I Cytochrome c oxidase II Cytochrome c Displacement loop Ethidium bromide Giai doan High-performance liquid chromatography (sac ky long hiéu nang cao) Kearns-Sayre syndrome (hdi ching KSS) Leber”s hereditary optic neuropathy (hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyén theo Leber) Lân cận u Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes (hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch) Mitochondrial ADN (ADN ty thé) Nicotinamide adenine dinucleotide (dang khử) NADH dehydrogenase 1 NADH dehydrogenase 3 Oxidative phosphorylation (phosphoryl héa oxy hóa) Polymerase chain reaction (phan tng chudi polymerase) Restriction fragment length polymorphism (da hinh chiéu dài các đoạn cắt giới han) Reactive oxygen specles (dạng oxy hoạt động) Tumor- lymph Node- Metastases Ung thu dai truc trang Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) DANH MỤC BÁNG Bang 1. Phân chia giai đoạn UTĐTT của AJCC -2002.-- 6 sec svcsesvcex 14 Bảng 2.

Số lượng bệnh nhân UTĐTTT theo đặc điểm bệnh học. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự các cặp mỗi dùng trong nghiên cứu .---------:-z©csz+css+ 36 Bảng 2. Điều kiện phản ứng PCR đối với các cặp mùii.

Cac enzyme giới hạn dùng trong nghiên CỨU. ¿+6 +++£+x+v£se+eesx 39 Bang 2. Các vector mang đoạn chèn. - -- + + + kEx* kh nh ng ng rưy 40 Bảng 2.

Trình tự các cặp mỗi sử dụng trong phản ứng PCR nhân đoạn ADN để nhân dòng cho dựng đường chuẩn và Real-time PCR.----2¿©2©csz+css¿ 43 Bảng 3. Tần suất của biến đổi A4164G và mối liên quan với các đặc điểm bệnh học 18918056900 Ẻ3. Tần suất biến đổi A10398G và mối liên quan với các đặc điểm bệnh học lir. Các vị trí biến đổi trên gen COX-2 ty thể ở 3l mẫu mô UTĐTT.