Luận án tiến sĩ biểu hiện gen mã hoá kháng thể kháng cd20 và thử nghiệm để phát

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trần Minh Đạo 2. Lê Quang Huấn Hà Nội – 2014 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS. Trần Minh Đạo và PGS.

Lê Quang Huấn. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Nghiên cứu sinh Phạm Thu Thùy i TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lời cảm ơn Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS.

Trần Minh Đạo – Giám đốc bệnh viện 198 – Bộ Công an và PGS. Lê Quang Huấn – Trƣởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. Nguyễn Thị Hồng Vân – Trƣởng bộ môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học – Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T. Lã Thị Huyền, các cô chú, anh chị và các bạn công tác tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa Vi sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa giải phẫu bệnh – Học viện quân y, Trung tâm Ung bƣớu - Bệnh viện 198 và Viện chăn nuôi đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho tôi.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những ngƣời thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Nghiên cứu sinh Phạm Thu Thùy ii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Mục lục Trang phụ bìa Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii Danh mục các bảng, biểu ix Danh mục các hình x MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1. Đại cƣơng ung thƣ máu 3 1.

Tình hình ung thƣ máu trên thế giới và Việt Nam 5 1. Các phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị ung thƣ máu 7 1. Bệnh ung thƣ lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin 8 lymphoma) 1. KHÁNG NGUYÊN CD20 11 1.

Cấu trúc gen và protein CD20 11 1. Chức năng của CD20 trong cơ thể 12 1. Kháng nguyên CD20 – mục tiêu phân tử trong điều trị ung thƣ và ung thƣ máu 14 1. Tình hình nghiên cứu kháng nguyên CD20 tái tổ hợp 16 1.

KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (mAb), KHÁNG THỂ SCFV VÀ 17 KHÁNG THỂ PHAGE-SCFV 1. Kháng thể 17 1. Kháng thể đơn dòng (mAb) 18 1. Kháng thể đơn chuỗi (kháng thể scFv) 20 1.

Kháng thể phage-scFv 22 1. Ứng dụng mAb trong chẩn đoán bệnh ung thƣ máu 25 1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất mAb đặc hiệu kháng nguyên iii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CD trên thế giới 27 1. KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CD20 28 1.

Cơ chế hoạt động của kháng thể đặc hiệu CD20 28 1. Một số mAb đặc hiệu CD20 đang đƣợc sử dụng trong điều trị 32 1. Tình hình nghiên cứu mAb đặc hiệu CD20 hiện nay 36 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.

Hóa chất và trang thiết bị 40 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2. Các phƣơng pháp thao tác với DNA VÀ RNA 41 2. Tách chiết RNA từ máu của bệnh nhân và tủy gà đã gây miễn 42 dịch 2.

RT-PCR nhân bản gen mã hóa kháng nguyên CD20 và kháng 42 thể scFv đặc hiệu CD20 2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2. Biến nạp plasmid vào tế bào E. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E.

Tạo vector tái tổ hợp chứa đoạn gen CD20 45 2. Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2 46 2. Điện di gel agarose 46 2. Thu đoạn DNA từ gel agarose 47 2.

Tinh sạch DNA và cắt, gắn DNA 47 2. Phƣơng pháp nhân gen bằng PCR 48 2. Xác định trình tự nucleotide 49 2. Các phƣơng pháp thao tác với protein tái tổ hợp 49 2.

Biểu hiện gen trong tế bào E. Tinh sạch protein tái tổ hợp 50 2. Điện di protein 51 2. Kĩ thuật Western blot và Dot blot 51 iv TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20 52 2. Kĩ thuật phage display 53 2. Tạo kháng thể phage-scFv từ thƣ viện Griffin. Sàng lọc kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên đích 53 2.

Xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20 54 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3. TẠO KHÁNG NGUYÊN CD20 TÁI TỔ HỢP 57 3. Tách chiết RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin 57 3.

Nhân bản các gen mã hoá CD20 58 3. Tách dòng gen mã hoá CD20 58 3. Xác định trình tự gen mã hóa CD20 59 3. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên CD20 60 3.

Biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của CD20 61 3. KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG CD20 TẠO RA 64 3. THU NHẬN GEN MÃ HÓA scFv KHÁNG CD20 TỪ GÀ 65 3. Tạo gen tái tổ hợp mã hóa cho scFv từ gà gây miễn dịch 65 3.

Tạo phage biểu lộ scFv và sàng lọc các scFv có khả năng gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích 68 3. TẠO KHÁNG THỂ scFv KHÁNG CD20 69 3. Tách dòng gen antiCD20 mã hóa scFv 69 3. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)/antiCD20 69 3.

Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv 71 3. Tinh sạch kháng thể scFv đặc hiệu CD20 76 3. Khả năng liên kết của scFv với kháng thể cộng hợp 78 3. Độ ổn định của scFv tinh sạch 79 3.

TẠO KHÁNG THỂ scFv-CH2 KHÁNG CD20 81 3. Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa scFv-CH2 81 3. Sàng lọc hệ vector biểu hiện scFv-CH2 82 3. Nhân dòng các vector biểu hiện scFv-CH2 82 v TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Biểu hiện kháng thể scFv-CH2 trong hệ vector 83 3. Chọn vector biểu hiện scFv-CH2 84 3. Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv-CH2 85 3. Tinh sạch kháng thể scFv-CH2 88 3.

Độ ổn định của scFv-CH2 tinh sạch 91 3. Khả năng liên kết của scFv-CH2 với CD20 91 3. THỬ NGHIỆM scFv-CH2 PHÁT HIỆN CD20 TRONG 93 HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHL 3. Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot 93 3.

Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA 95 3. Lựa chọn độ pha loãng huyết thanh 95 3. Thử nghiệm scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA 96 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 100 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 PHỤ LỤC vi TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Danh mục các kí hiệu, các từ viết tắt ADCC Antibody dependent cellular Gây độc tế bào phụ thuộc cytotoxicity kháng thể ADC Antibody drug conjugate Kháng thể mang thuốc AIDS acquired immune deficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch syndrome mắc phải ALL Acute Lymphocytic Leukemia Ung thƣ tế bào lympho cấp tính AML Acute Myelogenous Ung thƣ bạch cầu dòng tủy cấp Leukemia tính CD Cluster of differenciation Cụm biệt hóa CDC Complement dependent Gây độc tế bào phụ thuộc bổ cytotoxicity thể cDNA Complementary ADN bổ sung Deoxyribonucleic acid CDR Complementarity determining Vùng quyết định bổ trợ region CLL Chronic Lymphocytic Ung thƣ tế bào lympho mạn Leukemia tính CML Chronic Myelogenous Ung thƣ bạch cầu dòng tủy Leukemia mạn tính CR Complete remission Đáp ứng hoàn toàn DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ELISA Enzyme-Linked Kỹ thuật miễn dịch liên kết ImmunoSorbent Assay enzyme FDA Food and Drug Cục Quản lý thuốc và thực Administration phẩm HAMA Human against mouse allergic Hiện tƣợng mAb có nguồn gốc vii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com từ chuột khi tiêm vào cơ thể do không tƣơng hợp với hệ miễn dịch của ngƣời, khiến cơ thể sinh ra kháng thể chống lại nó HBV Hepatitis B virus Virut viêm gan B HL Hodgkin’s lymphoma U lympho Hodgkin IFN Interferon IPTG Isopropyl β-D-thiogalactoside Chất cảm ứng IPTG IARC International Agency for Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ Research on Cancer Quốc tế KT Kháng thể mAb Monoclonal antibody Kháng thể đơn dòng NHL non-Hodgkin’s lymphoma Ung thƣ lympho không Hodgkin NK cell Nature killer cell Tế bào giết chết tự nhiên ORR Overall response rate Tỉ lệ phản ứng tổng thể PCD Programmed cell death Tế bào chết theo chƣơng trình PBS Phosphate buffered saline PR Partial remission Đáp ứng một phần PVDF Polyvinylidene fluoride Màng PVDF RA Rheumatoid arthritis Viêm kh ớp dạng thấp RNA Ribonucleic acid ARN RT-PCR Reverse transcription Phản ứng chuỗi phiên mã Polymerase chain Reaction ngƣợc scFv Single-chain variable Đoạn biến thể đơn chuỗi fragment TBS Tris-buffered saline TMB Tetramethylbenizidine TTBS Tween-20- Tris-buffered saline WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới viii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Danh mục các bảng Bảng 1. Phân loại NHL theo WHO - 2008 8 Bảng 1.

Phân loại NHL trong điều trị (Working Formulation - 9 1982) Bảng 1.3 Một số mAb kháng CD20 đã đƣợc phê chuẩn và dùng 37 trong điều trị Bảng 2. Trình tự các mồi sử dụng để tạo thƣ viện kháng thể scFv 39 từ gà gây miễn dịch Bảng 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng để tách dòng gen mã hóa 40 scFv từ gà Bảng 2. Thành phần phản ứng RT-PCR 43 Bảng 2.

Thành phần phản ứng gắn (ligase) 44 Bảng 2. Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn 48 Bảng 2. Thành phần phản ứng gắn DNA 48 Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR 49 Bảng 3.

Mức độ đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau khi 64 gây miễn dịch lần thứ 3 Bảng 3.