Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu điều chế, phân bố sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thư của phức hợp miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------- Nguyễn Thị Thu “NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƢ CỦA PHỨC HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 131I-RITUXIMAB” LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------- Nguyễn Thị Thu “NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƢ CỦA PHỨC HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 131I-RITUXIMAB” Chuyên ngành: Mô - phôi và tế bào học Mã số: 62420117 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. MAI TRỌNG KHOA 2. VÕ THỊ THƢƠNG LAN XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN Ngƣời hƣớng dẫn khoa học Chủ tịch hội đồng đánh giá Luận án Tiến sĩ GS. Mai Trọng Khoa GS.

Phan Văn Chi Hà Nội - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án tiến sĩ “Nghiên cứu điều chế, phân bố sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thƣ củaphức hợp miễn dịch phóng xạ131I- rituximab” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và tài liệu trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Tất cả những tham khảo và kế thừa đều đƣợc trích dẫn và tham chiếu đầy đủ. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ quý thầy cô, các bạn đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.

Tôi xinbày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: - GS. Mai Trọng Khoa, PGS. Võ Thị Thương Lan, đã nhiệt tình hướng dẫn chuyên môn, truyền cho tôi kiến thức, và là tấm gương sáng cho tôi noi theo trên con đường nghiên cứu khoa học. - Các thầy cô trong bộ môn Mô Phôi và Tế bào học, khoa Sinh học, trường Đại học khoa học tự nhiên đã luôn động viên, giúp đỡ chuyên môn và nhắc nhở kịp thời để tôi hoàn thành luận án.

- Các bạn đồng nghiệp tại Trung Tâm Nghiên cứu và điều chế đồng vị phóng xạ, Viện Nghiên cứu hạt nhân đã tham gia thực nghiệm, giúp đỡ, và đồng hành cùng tôi trong thời gian dài tìm tòi, nghiên cứu gắn và điều chế dược chất phóng xạ trong luận án. - Các bác sỹ Tại Trung Tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, bệnh viện Bạch Mai, các bạn đồng nghiệp tại Học Viện Quân Y đã giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu đánh giá tiền lâm sàng trong luận án này. - Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia đình tôi đã luôn dành cho tôi những yêu thương và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập. Xin chân thành cảm ơn mọi người đã giúp tôi hoàn thành luận án này! Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục.

1 Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt. 3 Danh mục các bảng. 5 Danh mục các hình ảnh, đồ thị. 9 Chƣơng 1: TỔNG QUAN.

Bệnh u lympho ác tính không Hodgkin. Các phƣơng pháp điều trị bệnh ULAKH và điều trị RIT. Dƣợc chất phóng xạ dùng trong điều trị RIT. Đồng vị phóng xạ và các phƣơng pháp gắn kháng thể với 131I.

26 Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị. Phƣơng pháp nghiên cứu. Nghiên cứu điều chế phức miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab.

Kiểm tra chất lƣợng phức hợp 131I-rituximab. Đánh giá khả năng gắn với tế bào ung thƣ. Đánh giá phân bố, đào thải và an toàn trên động vật thực nghiệm. Xử lý kết quả.

Xây dựng tiêu chuẩn Cơ sở của 131I-rituximab. 51 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Kết quả khảo sát các điều kiện gắn phóng xạ để điều chế phức hợp 131I- rituximab. Kết quả khảo sát nồng độ chloramin T tham gia trong phản ứng tạo phức hợp 131I-rituximab.

Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể tạo phức hợp 131I-rituximab. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo phức hợp 131I-rituximab. 56 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kết quả khảo sát pH phản ứng tạo phức 131I-rituximab.

Kết quả điều chế phức hợp 131I-rituximab theo hoạt độ riêng. Kết quả tinh chế phức hợp 131I-rituximab và theo dõi độ ổn định. Kết quả đánh giá tính ổn định của phức hợp 131I-rituximab. Kết quả kiểm tra chất lƣợng phức hợp 131I-rituximab.

Kết quả kiểm tra độ tinh khiết hoá phóng xạ. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ. Kết quả thử vô khuẩn và nội độc tố vi khuẩn. Kết quả kiểm tra tính ổn định.

Kết quả gắn với tế bào ung thƣ. Kết quả đánh giá phân bố, đào thải và an toàn của 131I-rituximab trên động vật thực nghiệm. Chứng minh sự thành công của việc điều chế phức hợp miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab có thể sử dụng trong điều trị lâm sàng. 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.

111 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 112 PHỤ LỤC 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADCC Độc tính với tế bào phụ thuộc kháng thể (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) ALL Ung thƣ nguyên bào tủy cấp (Acute Lymphoblastic Leukemia) AML Ung thƣ bạch cầu dạng tủy (Acute Myeloid Leukemia) BET Thử nội độc tố vi khuẩn (Bacterial Endotoxins Test) Bq Becquerel CD Cụm biệt hoá (cluster differentiation) CD20 Cụm biệt hóa CD20 (Clusters differentiation 20) CDC Độc tính với tế bào phụ thuộc bổ thể (Complement Dependent Cytotoxicity) CDCC Độc tính với tế bào phụ thuộc bổ thể (Complement Dependent Cellular Cytotoxicity) DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DNA Deoxyribonucleic acid EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EU Endotoxin Unit FDA Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) FPLC Fast Protein Liquid Chromatography FTM Fluid Thyoglicolate Medium GBq Giga Becquerel IgG Globulin miễn dịch (Immunoglobulin) KDa, Da Kilo Dalton, Dalton KeV Kiloelectron volt Mab, MAb Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) MeV Mega electron volt NHL U lympho ác tính không Hogdkin (non-Hodgkin’s lymphoma) NSB Phần gắn không đặc hiệu (Non Specific Binding) 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NTA Nitroacetic axit PBS Phosphat Buffer Saline PC Sắc ký giấy (Paper chromatography) PET-CT Máy chụp cắt lớp bằng đồng vị phát positron (Positron Emission Tomography) PTS-100 Máy kiểm tra nội độc tố (Endosafe® Portable Test System) RBC Tế bào hồng cầu (Red Blood Cell) RCP Radiochemical purity Rf Hệ số lƣu giữ (Retardation factor, Retention factor) RIA Định lƣợng phóng xạ miễn dịch (radioimmunoassay) RIT Điều trị miễn dịch phóng xạ (radioimmunotherapy) SCD Casein Soyabean Digest SE Standard Error SGOT Huyết thanh Glutamic Oxaloacetic Transaminase SGPT Huyết thanh Glutamic Pyruvic Transaminase SPECT Thiết bị chụp cắt lớp điện toán bằng bức xạ đơn photon (Single Photon Emission Computed Tomography) TCC Sắc ký kiểm tra (Tec-Control Chromatography) TCCS-DPPX Tiêu chuẩn Cơ sở Dƣợc phẩm phóng xạ TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) ULAKH U lympho ác tính không Hodgkin (non-Hodgkin’s lymphoma) ULKH U lympho không Hodgkin (Hodgkin’s lymphoma) VEGF Yếu tố tăng sinh mạch (Vascular Endothelial Growth Factor) WBC Tế bào bạch cầu (White Blood Cell) 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Hiệu quả điều trị NHL bằng RIT của một số tác giả. Các kháng thể gắn phóng xạ đang đƣợc nghiên cứu.

Các đồng vị phóng xạ dùng trong điều trị đích. Khảo sát nồng độchloramin T. Thứ tự thực hiện gắn kháng thể với 131I. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng.

Bảng số liệu hiệu suất gắn và tỉ lệ mol. Hiệu suất gắn phóng xạ theo pH. Kết quả so sánh kiểm tra RCP của 131I-rituximab. Kết quả đo phổ gamma 131I-rituximab.

Tính chất vật lý phóng xạ của 131I-rituximab. Kết quả theo dõi thử vô khuẩn. Kết quả kiểm tra nội độc tố vi khuẩn. Tổng hợp hiệu suất gắn và độ sạch hóa phóng xạ của phức kháng thể với phóng xạ 131I.

Tóm tắt chỉ tiêu chất lƣợng của 131I-rituximab. Kết quả thu tế bào bạch cầu từ các mẫu máu bệnh nhân NHL, CD20(+)85 Bảng 3. Tỷ lệ gắn của 131I-rituximab gắn với CD20 trên bạch cầu máu ngoại vi bệnh nhân NHL. Phân bố thuốc phóng xạ 131I-rituximab trên chuột.

Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 500 Ci. Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 1000 Ci. Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 1500 Ci. Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 2000 Ci.

Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 5000 Ci. Diễn biến cân nặng của thỏ trong quá trình nghiên cứu. Diễn biến nhiệt độ của thỏ trong quá trình nghiên cứu. Số lƣợng hồng cầu trong máu ngoại vi của thỏ.

99 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Nồng độ Hemoglobin trong máu ngoại vi của thỏ. Số lƣợng bạch cầu trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ. Số lƣợng tiểu cầu trong máu ngoại vi của các nhóm.

Nồng độ ure trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ. Nồng độ creatinin trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ. Nồng độ glucose trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ. Nồng độ SGOT trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ.

Nồng độ SGPT trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ. 104 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1. Tế bào B ung thƣ có biểu hiện kháng nguyên CD20. Kháng nguyên CD20 xuyên màng tế bào 4 lần.

Cấu trúc của kháng thể rituximab. Cơ chế tiêu diệt ung thƣ bằng bức xạ. Hình ảnh bệnh ULKH. Cho thỏ uống lugol , đo nhiệt độ thỏ.

Sơ đồ chung quá trình nghiên cứu điều chế 131I-rituximab. Hiệu suất gắn theo nồng độ chloramin T. Hiệu suất gắn điều chế phức hợp 131I-rituximab. Hiệu suất gắn theo nồng độkháng thể.

Đồ thị hiệu suất gắn kháng thể rituximab với 131I. Tách sản phẩm theo các hoạt độ riêng. Đồ thị kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab. Tách 131I-rituximab qua cột sephadex dùng dung dịch rửa giải là phosphat và nƣớc muối sinh lý 0,9%.

Đồ thị đánh giá tính bền vững của 131I-rituximab trƣớc và sau khi tách qua cột sephadex. Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab sau khi điều chế, TCC, autoradiography. Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab sau khi bảo quản 22 ngày, TCC, autoradiography. Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab, điện di, 20 x 200mm, 60 phút, Bioscan.

Độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab, TLC, Bioscan .