Luận án tiến sĩ: Sử dụng cây sài đất để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN NGUYÊN NGỌC SỬ DỤNG CÂY SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis) ĐỂ PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) DO VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY RA TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN HUẾ, NĂM 2024 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN NGUYÊN NGỌC SỬ DỤNG CÂY SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis) ĐỂ PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) DO VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY RA TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 9620301 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. Nguyễn Quang Linh PGS. Nguyễn Ngọc Phước HUẾ, NĂM 2024 i LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Trần Nguyên Ngọc, nghiên cứu sinh ngành Nuôi trồng Thủy sản, khóa 2021 của khoa Thủy sản, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế. Tôi xin cam đoan Luận án “Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân tôi được sự hướng dẫn của PGS.

Nguyễn Quang Linh và PGS. Nguyễn Ngọc Phước. Luận án này được tài trợ bởi đề tài cấp nhà nước mã số ĐTĐL.CN-56/22 (Ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất một số chế phẩm bổ sung vào thức ăn thủy sản) và Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) và nhóm nghiên cứu mạnh của Đại học Huế mã số NCM. Do đó, các thông tin được sử dụng tham khảo trong Luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố và được tôi trích dẫn nguồn tham khảo rõ ràng.

Kết quả nghiên cứu trong Luận án được thực hiện một cách khoa học, trung thực và chưa từng được bảo vệ ở bất kỳ một học vị nào. Tôi xin cam kết và đảm bảo những lời khai này hoàn toàn đúng sự thật. Thừa Thiên Huế, ngày….năm 2024 TÁC GIẢ LUẬN ÁN Trần Nguyên Ngọc ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thiện Luận án, ngoài sự cố gắng không ngừng nghỉ của bản thân, cá nhân tôi còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế nơi tôi đang học tập và công tác đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian, kinh phí và công việc để tôi có thể vừa học tập, nghiên cứu vừa giảng dạy tại Nhà trường; xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Phòng Đào tạo và Công tác sinh viên trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã giúp đỡ tôi về các thủ tục pháp lý để hoàn thiện Luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản; Bộ môn Nuôi trồng Thủy sản, Bộ môn Bệnh học Thủy sản đã quan tâm tạo điều kiện, bố trí phân công các học phần giảng dạy hợp lý để tôi có thể vừa nghiên cứu vừa tham gia giảng dạy các học phần chuyên môn đang phụ trách. Ngoài ra, Ban chủ nhiệm Khoa, Bộ môn và quý thầy cô trong khoa Thủy sản cũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về cơ sở vật chất, trang thiết bị, phòng thí nghiệm để tôi thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu của Luận án. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. Nguyễn Quang Linh và PGS.

Nguyễn Ngọc Phước là hai nhà khoa học hướng dẫn Luận án, những người thầy tận tâm, mẫu mực, người đã mở ra định hướng nghiên cứu có tính hàn lâm cao và tận tình giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành Luận án. Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến GS. Lê Đức Ngoan, PGS. Nguyễn Ngọc Phước, PGS.

Lê Văn Dân, PGS. Nguyễn Duy Quỳnh Trâm, PGS. Tôn Thất Chất đã trực tiếp giảng dạy và hướng dẫn các học phần trong quá trình thực hiện Luận án. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Khoa dược, trường Đại học Y Dược, Đại học Huế đã tạo điều kiện và hỗ trợ về cơ sở vật chất trong việc triển khai một số nội dung nghiên cứu về xác định các hoạt chất sinh học và chân thành cảm ơn GS.

Nguyễn Thị Hoài (Trưởng khoa Dược), em Đoàn Quốc Tuấn đã hỗ trợ cho tôi trong việc thực hiện một số nội dung về định tính và định lượng các hoạt chất. Chúng tôi xin cảm ơn Quỹ học bổng đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) đã tài trợ một phần kinh phí để tôi thực hiện Luận án. Cảm ơn đề tài cấp quốc gia với mã số ĐTĐL.CN-56/22 do TS. Nguyễn Xuân Huy làm chủ nhiệm đã hỗ trợ nguồn kinh phí để thực hiện Luận án.

Xin cảm ơn nhóm nghiên cứu mạnh Đại học Huế mã số NCM. Nguyễn Ngọc Phước trưởng nhóm đã hỗ trợ kinh phí cho tôi hoàn thành bản Luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các em sinh viên khóa K52, K53, K54 của Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, đã hỗ trợ cho tôi trong việc thực hiện các thí nghiệm của Luận án. Cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình hai bên nội ngoại đã luôn luôn động viên tinh thần cho tôi trong thời gian thực hiện Luận án, đặc biệt tôi iii xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình nhỏ thân yêu của tôi là vợ và hai con đã luôn đồng hành sát cánh vượt qua mọi khó khăn, hỗ trợ đắc lực cho tôi về tất cả mọi mặt để tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh và Luận án.

Mặc dù đã có nhiều nỗ lực và cố gắng để hoàn thành Luận án nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được những góp ý chân thành từ các nhà khoa học, quý thầy giáo, cô giáo, đồng nghiệp và độc giả để Luận án được hoàn thiện hơn. Trân trọng cảm ơn! TÁC GIẢ LUẬN ÁN Trần Nguyên Ngọc iv TÓM TẮT Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) có tốc độ sinh trưởng nhanh, nuôi mật độ cao và khả năng thích nghi tốt với độ mặn, được nuôi phổ biến không những ở Việt Nam mà còn nhiều nước trên thế giới. Dịch bệnh do Vibrio là thách thức lớn nhất cho nghề nuôi tôm thẻ chân trắng hiện nay, đặc biệt bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là một trong những nguyên nhân chính gây tỷ lệ chết lên đến 100% cho tôm nuôi, làm sụt giảm nghiêm trọng sản lượng tôm nuôi ở các nước Đông Nam Á và Châu Mỹ.

Kháng sinh thường được sử dụng để trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thuỷ sản, nhưng lại không có tác dụng với bệnh này và lại gây ô nhiễm môi trường, mất vệ sinh an toàn thực phẩm và tạo ra các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh. Luận án “Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” tại Thừa Thiên Huế được thực hiện từ 2021 đến 2024 với mục tiêu xác định được khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) của cao chiết cây sài đất trên tôm thẻ chân trắng nhằm đưa ra giải pháp phòng bệnh an toàn và hiệu quả cho nghề nuôi tôm tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu bao gồm: (1) Xác định thành phần hoạt chất sinh học có trong cây sài đất; (2) Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng của cao chiết sài đất; (3) Ảnh hưởng của cao chiết sài đất đến đáp ứng miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng; (4) Đánh giá hiệu quả của cao chiết cây sài đất lên khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng.

Kết quả nghiên cứu về thành phần các hoạt chất sinh học trong cây sài đất, đã định tính được một số hoạt chất sinh học hiện diện trong ba dung môi methanol, hoặc ethanol, hoặc nước cất như alkaloid, flavonoid, polyphenol, carotenoid, chất béo, tinh dầu, tanin, acid hữu cơ và hợp chất khử. Hai hoạt chất có tính kháng khuẩn như polyphenol tổng và flavonoid được xác định thông qua hai đường chuẩn acid gallic và rutin. Hàm lượng polyphenol tổng có trong cao chiết với dung môi methanol hoặc ethanol hoặc nước cất lần lượt là 74,33 ± 4,49 (mg GAE/g cao chiết); 73,65 ± 5,44 (mg GAE/g cao chiết); 53,07 ± 1,48 (mg GAE/g cao chiết), hàm lượng flavonoid trong dung môi methanol (24,59 ± 2,19 mg RE/g cao chiết), ethanol (20,63 ± 4,30 mg RE/g cao chiết) hoặc nước cất (3,20 ± 0,07 mg RE/g cao chiết). Đồng thời đã xác định được hiệu suất cao chiết toàn phần trong cây sài đất ở dung môi methanol (11%), ethanol (11,3%) hoặc nước cất (18,2%).

Cao chiết sài đất trong ba dung môi đều có khả năng kháng khuẩn mạnh với V. parahaemolyticus với đường kính vòng diệt khuẩn dao động từ 13,1 đến 15,1 mm, trong đó cao chiết ở dung môi methanol cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất (đường kính vòng diệt khuẩn cao nhất là 15,1 mm). Giá trị MIC của cao chiết sài đất đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus trong các dung môi methanol hoặc ethanol hoặc nước cất lần lượt là v 31,25 mg/L; 62,5 mg/L và 2500 mg/L.

Giá trị MBC của cao chiết sài đất trong dung môi methanol là 31,25 mg/L; ethanol là 62,5 mg/L và nước cất là 5000 mg/L. Khi cho tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn có bổ sung cao chiết sài đất ở các hàm lượng khác nhau là 31,25 mg/kg thức ăn (NT1); 312,5 mg/kg thức ăn (NT2) và 625 mg/kg thức ăn (NT3) trong 3 tuần, bổ sung 2 lần với liệu trình cách tuần cho thấy tôm có tốc độ tăng trưởng tốt, cải thiện hoạt động đáp ứng miễn dịch thông qua tăng cường các chỉ số tế bào máu, hoạt động sản xuất của các loại enzyme lysozyme (LYS), phenoloxydase (PO), superoxide dismutase (SOD), hoạt động thực bào (PA) và gia tăng tỷ lệ sống khi cảm nhiễm với V. Tỷ lệ chết tích lũy ở thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus theo con đường tiếp xúc trực tiếp (nuôi chung tôm cảm nhiễm với tôm không cảm nhiễm) ở các nghiệm thức bổ sung cao chiết sài đất là 24% (NT1), 12% (NT2) và 16% (NT3) thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (không bổ sung cao chiết) chiếm (44%).

Tỷ lệ chết tích lũy ở thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus theo con đường tiếp xúc gián tiếp (nuôi riêng tôm cảm nhiễm với tôm không cảm nhiễm) ở nghiệm thức đối chứng (không bổ sung cao chiết) chiếm 24%, nghiệm thức NT1 là 8%, NT2 là 4% và NT3 là 8%. Tỷ lệ bảo hộ cao chiết sài đất (RPS) bổ sung vào thức ăn của NT1, NT2 và NT3 lần lượt là 63%, 69% và 55%.