Luận án tiến sĩ thủy sản

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHẠM THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU VI KHUẨN Vibrio GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ HỒNG MỸ Sciaenops ocellatus (LINNAEUS, 1766) VÀ THỬ NGHIỆM BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ BỆNH BẰNG DIỆP HẠ CHÂU (Phyllanthus amarus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN THỪA THIÊN HUẾ - 2022 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHẠM THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU VI KHUẨN Vibrio GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ HỒNG MỸ Sciaenops ocellatus (LINNAEUS, 1766) VÀ THỬ NGHIỆM BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ BỆNH BẰNG DIỆP HẠ CHÂU (Phyllanthus amarus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 9620301 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. NGUYỄN QUANG LINH PGS. NGUYỄN DUY QUỲNH TRÂM THỪA THIÊN HUẾ - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của tôi, số liệu được trình bày trong Luận án này là bản gốc của tác giả, trung thực, chính xác, danh dự và chưa từng được bảo vệ ở bất kỳ một học vị nào. Thừa Thiên Huế, ngày tháng 7 năm 2022 TÁC GIẢ LUẬN ÁN Phạm Thị Hải Yến ii LỜI CÁM ƠN Để thực hiện và hoàn thiện Luận án, ngoài sự cố gắng không ngừng nghỉ của bản thân, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế nơi tôi đang học tập và công tác đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian, kinh phí và công việc để tôi có thể vừa học tập, nghiên cứu vừa giảng dạy tại Nhà trường; xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản; Bộ môn Bệnh Thủy sản đã bố trí phân công các học phần giảng dạy hợp lý để tôi có thể vừa nghiên cứu vừa tham gia giảng dạy các học phần chuyên môn đang phụ trách, đồng thời Khoa và Bộ môn cũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về cơ sở vật chất, trang thiết bị, phòng thí nghiệm và các thiết bị cần thiết để tác giả thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu thử nghiệm trong khuôn khổ của Luận án. Để đạt được kết quả nghiên cứu tốt và hoàn thiện được Luận án, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Linh (Giám đốc Đại học Huế); PGS.TS Nguyễn Duy Quỳnh Trâm (Trưởng Khoa Thủy sản) là 2 nhà khoa học hướng dẫn Luận án, là những người Thầy, người Cô đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ chỉ bảo tận tình cho em từ việc hình thành nên ý tưởng nghiên cứu có tính hàn lâm đến việc triển khai thực hiện và xuyên suốt quá trình nghiên cứu đến khi hoàn thành Luận án, đặc biệt là nhờ sự giúp đỡ của Thầy và Cô trong việc hỗ trợ Nghiên cứu sinh đăng được bài báo quốc tế trong các danh mục (Web of Science và Scopus), chúng tôi xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Ngọc Phước và PGS.TS Trần Quốc Dung là 2 nhà khoa học đã hướng dẫn thành công các chuyên đề nghiên cứu cho Nghiên cứu sinh. Nghiên cứu sinh xin cảm ơn đến PGS.TS Tôn Thất Chất, PGS.TS Lê Văn Dân và các thầy cô, đồng nghiệp giảng dạy đã giúp đỡ mọi mặt. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã tạo điều kiện và hỗ trợ về cơ sở vật chất trong việc triển khai một số nội dung nghiên cứu về công nghệ sinh học và chân thành cảm ơn anh Đặng Thanh Long đã hỗ trợ cho tôi trong việc thực hiện một số nội dung về tách chiết gen.

Chúng tôi xin cảm ơn rất nhiều đến sự hỗ trợ của đề tài KH&CN cấp Bộ “Nghiên cứu quy trình tạo chế phẩm sinh học từ dịch chiết cây chó đẻ thân xanh (Phyllanthus amarus Schum) kết hợp vi sinh vật có lợi để phòng trị bệnh tôm, cá, mã số CT-2018- DHH-07 và đề tài KH&CN cấp Đại học Huế “Xác định thành phần loài và sự hiện diện các gen độc tố của vi khuẩn Vibrio gây bệnh xuất huyết trên cá Hồng mỹ Sciaenops ocellatus (Linnaeus, 1766) nuôi tại Thừa Thiên Huế, mã số: DHH-2021-02- 153; Cảm ơn các em sinh viên Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế các Khóa từ K49; K50 và K51 đã tham gia nghiên cứu cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án. iii Mặc dù tác giả đã có nhiều nổ lực, cố gắng tìm học, học hỏi và nghiên cứu để hoàn thành Luận án tốt nhất, nhưng không tránh khỏi những sai sót, chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp, hướng dẫn đến từ các nhà khoa học, thầy cô, anh chị em đồng nghiệp và bạn đọc để Luận án được hoàn thiện tốt hơn. Xin trân trọng ! TÁC GIẢ LUẬN ÁN Phạm Thị Hải Yến iv TÓM TẮT Nghiên cứu thực hiện nhằm mục tiêu: (1) Xác định được vi khuẩn Vibrio chính gây bệnh xuất huyết ở cá Hồng mỹ (Sciaenops ocellatus) nuôi lồng tại Thừa Thiên Huế; (2) xác định sự hiện diện của các gen độc tố được phân lập từ các chủng vi khuẩn Vibrio và liều gây chết 50 % (Lethal Dose, LD50) của tác nhân chính gây bệnh xuất huyết trên cá Hồng mỹ; (3) đồng thời, kết quả nghiên cứu cũng xác định được khả năng kháng vi khuẩn Vibrio spp. của cao chiết Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) và sử dụng cao chiết để phòng, điều trị bệnh xuất huyết do vi khuẩn Vibrio spp.

gây ra ở cá Hồng mỹ Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn Vibrio từ 62 mẫu cá Hồng mỹ có dấu hiệu bệnh xuất huyết được thu ở 10 vị trí thuộc xã Hải Dương và thị trấn Thuận An, thành phố Huế. Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và kiểm tra test sinh hóa của 48 chủng vi khuẩn Vibrio phân lập được từ mẫu cá bệnh bao gồm: 28 chủng Vibrio alginolyticus, 8 chủng V. fluvialis và 5 chủng V. Kết quả giải trình tự gen cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập có tỷ lệ có tương đồng với các chủng Vibrio trên ngân hàng GenBank dao động gen từ 98,05% đến 100%.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio là đồng nhất. Đồng thời, chúng tôi cũng đã xác định được sự hiện diện của 4 gen độc tố gồm: trh, tdh, tlh và toxR của các chủng Vibrio phân lập được bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu. Ngoài các nội dung nghiên cứu về phân lập gen, xác định sự hiện diện của một số gen chứa độc tố từ các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên cá Hồng mỹ, chúng tôi còn thực hiện nội dung: Xác định độc lực của các chủng Vibrio phân lập được gồm 2 thí nghiệm. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Vibrio spp., ở thí nghiệm này những chủng Vibrio spp.

gây chết cá trong 3 ngày thí nghiệm được xem là những chủng có độc lực và được sử dụng cho thí nghiệm 2. Thí nghiệm 2: Xác định liều gây chết 50% (LD50) gồm 4 nghiệm thức thí nghiệm và 1 nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức gồm 10 con cá được nuôi trong bể nhựa. Trong 4 nghiệm thức thí nghiệm: cá ở mỗi nghiệm thức được tiêm 0,1mL huyền phù vi khuẩn ở mật độ vi khuẩn V.

alginolyticus từ 105 đến 108 CFU/mL. Ở nghiệm thức đối chứng, cá được tiêm 0,1 mL nước muối sinh lý (0,85% NaCl). Tỷ lệ chết được theo dõi trong 14 ngày. Liều lượng gây chết LD50 của vi khuẩn được xác định theo phương pháp của Reed and Muench (1938).

Từ 48 chủng vi khuẩn Vibrio spp., chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm xác định độc lực của các chủng vi khuẩn gây bệnh, trong tổng số 48 chủng đó chỉ có loài V. alginolyticus gây chết cá trong 3 ngày thí nghiệm. Tuy nhiên chỉ có 23/28 chủng V. alginolyticus (có mang ít nhất 1 gen độc tố) gây chết cá đạt từ 60-100%.

alginolyticus gây chết cá với tỷ lệ 100 %. Từ đó, kết quả nghiên cứu đã xác định được 2 chủng V. alginolyticus YVL24 mang 3 gen độc tố (toxR; tdh, tlh) và 2 chủng V. alginolyticus YHTH44 có mang 3 gen độc tố (toxR; trh và tlh) là tác nhân chính gây bệnh xuất huyết trên cá Hồng mỹ (S.

ocellatus) nuôi lồng tại Thừa Thiên Huế. Qua kết quả thí nghiệm cũng đã xác định được độc lực và liều gây chết LD50 của 4 chủng vi khuẩn V. alginolyticus (YHD7, YVL24, YVL22 và YHTH44) lần lượt là: 6,5 x 105; 8,1 x 105 ; 1,7 x 106; và 1,9 x 106 CFU/mL. Kết quả gây bệnh thực nghiệm ở điều kiện in vivo cho thấy cá thí nghiệm cũng xuất hiện các dấu hiệu bệnh lý tương tự với các dấu hiệu bệnh lý của cá nuôi lồng mắc bệnh: xuất huyết ở mắt, da, vây, tuột vẩy và đuôi bị ăn mòn.

Kết quả nghiên cứu mô bệnh học cá Hồng mỹ cảm nhiễm V. alginolyticus trong điều kiện thực nghiệm cho thấy vi khuẩn V. alginolyticus gây xuất huyết và hoại tử trên các mô gan, thận, lách, não và cơ. Bên cạnh đó, 4 chủng vi khuẩn này đều nhạy cảm với các loại kháng sinh như Tetracyline, Doxycycline, Cefotaxime và kháng hoàn toàn với kháng sinh Amoxicinllin, Ampicillin, Erythromycin.

Để nghiên cứu khả năng phòng và điều trị bệnh của Diệp hạ châu chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm: 1) Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Diệp hạ châu (Lấy 100 µL dung dịch vi khuẩn ở mật độ 106 CFU/mL, dàn đều trên đĩa thạch MHA và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Dùng ống thuỷ tinh đục các lỗ trên đĩa thạch với đường kính 6 mm. Nhỏ 100 µL cao chiết cây Diệp hạ châu với các nồng độ 500, 400, 300, 200 và 100 mg/mL vào các lỗ thạch trên đĩa môi trường đã cấy vi khuẩn. Ở mẫu đối chứng âm chỉ cho nước cất mà không bổ sung cao chiết vào giếng.

Mẫu đối chứng dương được chuẩn bị bằng cách dùng kẹp khử trùng gắp đĩa giấy có tẩm kháng sinh Tetracycline 30 µg (Te) cho vào lỗ đục trên đĩa môi trường. Mỗi nồng độ cao chiết và kháng sinh được bố trí trên ba đĩa thạch. Sau đó, các đĩa thạch chứa vi khuẩn, cao chiết và kháng sinh được nuôi cấy ở 28°C và kiểm tra đường kính vòng kháng khuẩn sau 24 giờ. Sau đó tiếp tục xác định nồng độ ức chế tối (MIC), nồng độ tiêu diệt vi khuẩn (MBC) và xác định ngưỡng an toàn của cao chiết đối với cá Hồng mỹ.

Kết quả nghiên cứu đã xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Diệp hạ châu đối với 4 chủng vi khuẩn V. alginolyticus (YHD7, YVL24, YVL22, YHTH44), cao chiết ở các nồng độ từ 100-500 mg/mL đều có khả năng kháng vi khuẩn V.