Luận án tiến sĩ sinh học: Đa hình hệ gen tôm sú Penaeus monodon Việt Nam phục vụ chọn giống

1 MỞ ĐẦU  Đặt vấn đề Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) là một trong những loài tôm có kích thước lớn và được coi là loài thủy sản nuôi kinh tế quan trọng ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, tôm sú đã và sẽ tiếp tục là một trong những đối tượng nuôi chủ lực cho xuất khẩu thủy sản đem về ngoại tệ cho đất nước. Diện tích và sản lượng tôm nước lợ của nước ta ngày càng tăng. Nhu cầu tôm giống hằng năm là 130 tỷ con (trong đó có 30 tỷ con giống tôm sú).

Năm 2016, diện tích nuôi tôm là 649.645 ha với sản lượng 657.282 tấn, giá trị xuất khẩu đạt trên 3,15 tỷ USD. Đến năm 2025, mục tiêu xuất khẩu tôm của Việt Nam đạt 10 tỷ USD; sản lượng 1,1 triệu tấn trên quy mô 750.000 ha; nhu cầu tôm bố mẹ khoảng 500.000 con, trong đó nhu cầu tôm sú bố mẹ là 100.000 con/năm (https://laodong. Chiến lược phát triển ngành nuôi tôm sú ở Việt Nam cũng như ở các quốc gia nuôi tôm trên thế giới là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường, sinh thái. Nền tảng cho chiến lược này là chú trọng phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng.

Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen tôm sú là vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng. Những nghiên cứu chi tiết về genome, transcriptome, proteome và bản đồ gen tôm sú sẽ cung cấp những thông tin sinh học quan trọng giúp cho việc xác định các tính trạng cần thiết như tính kháng bệnh, tính chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, tính trạng quyết định năng suất và chất lượng của tôm. Các chỉ thị phân tử (CTPT) cũng như các thông tin khác có được từ việc nghiên cứu về hệ gen và lập bản đồ gen tôm sú có vai trò rất quan trọng đối với công tác chọn giống và phát triển ngành công nghiệp nuôi tôm thương phẩm. Trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen tôm sú để phục vụ cho các mục tiêu nói trên, nghiên cứu đa dạng di truyền là một trong những hướng nghiên cứu được quan tâm và có ý nghĩa ứng dụng thiết thực đối với thành công của chiến lược quản lý lâu dài và bền vững nguồn lợi thủy sản.

2 Ngày nay, các CTPT đang ngày càng trở thành công cụ hữu hiệu được ứng dụng rộng rãi để đánh giá đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền, ứng dụng trong nghiên cứu cải tạo, chọn giống tôm chất lượng tốt, sạch bệnh. Trong số đó, chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại chọn lọc (AFLP) được xem là một trong những kỹ thuật hiện đại và hiệu quả cho phép đưa ra nhanh chóng và chính xác một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau. Nhiều kỹ thuật CTPT khác cũng được xây dựng để phát triển các chỉ thị DNA sử dụng rộng rãi cho nhiều mục đích nghiên cứu. Tùy thuộc vào mục đích cụ thể để lựa chọn loại CTPT phù hợp.

Đối với mục tiêu chọn giống, đa hình nucleotide đơn (SNP) được xem là một trong những loại CTPT hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay để chọn được các tính trạng quan trọng liên quan đến năng suất và chất lượng giống. Với những thế mạnh vượt trội, các CTPT ngày nay được sử dụng như những công cụ chọn lọc đắc lực đối với các tính trạng quan tâm trong các chương trình chọn giống ở nhiều loài vật nuôi, cây trồng và các loài thủy sản. Việc ứng dụng các CTPT giúp cho các nhà chọn giống nhận diện chính xác các gen quan tâm nhằm rút ngắn thời gian chọn giống. Hiệu quả cải tiến giống sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với các phương pháp chọn giống cổ điển nhờ thực hiện việc chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn mà thông qua CTPT liên kết với tính trạng đó.

Hiện nay, các nghiên cứu về di truyền phân tử trên đối tượng tôm sú vẫn còn ít và chưa tương xứng với vai trò của một đối tượng nuôi kinh tế quan trọng. Thông tin về các locus tính trạng định lượng (QTLs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng hầu như rất hiếm. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định mối tương quan giữa các SNP - loại biến dị phổ biến nhất trong hệ gen - với tính trạng tăng trưởng ở tôm sú để tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về chọn giống dựa trên CTPT là hướng nghiên cứu hết sức quan trọng và thiết thực đối với ngành công nghiệp nuôi tôm sú. Trong khuôn khổ của Đề tài “Lập bản đồ bộ gen tôm sú (Penaeus monodon)” thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm”.

3  Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.  Nội dung nghiên cứu (1) Đánh giá đa hình hệ gen ba quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển khác nhau của Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP; (2) Lai hỗn hợp 4 dòng tôm sú bố mẹ khác nhau về nguồn gốc địa lý để tạo vật liệu nghiên cứu thế hệ Go và G1; (3) Áp dụng kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự (GBS) để phân tích hệ gen tôm sú thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm thế hệ Go và G1 nhằm sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng; (4) Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) để đánh giá tiềm năng ứng dụng của SNP này đối với việc đánh giá nhanh chóng và chính xác các cá thể tôm nhằm hỗ trợ trong công tác chọn giống tôm sú.  Những đóng góp mới của luận án về mặt khoa học và thực tiễn (1) Luận án là nghiên cứu đầu tiên đưa ra đánh giá về đa dạng di truyền của ba quần đàn tôm sú tự nhiên từ các vùng biển Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP. (2) Sàng lọc được bộ chỉ thị SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh làm cơ sở cho việc tìm kiếm chỉ thị SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tôm sú.

Hai chỉ thị SNP được xác định trong nghiên cứu của luận án là phát hiện đầu tiên về chỉ thị SNP nằm trong exon của gen MHC ở họ giáp xác. Những kết quả này cung cấp dẫn liệu khoa học hữu ích cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống tôm sú. 4 Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu NỘI DUNG NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 1. Thu mẫu tôm sú từ 3 1.

DNA tổng số từ các Đánh giá đa hình quần đàn BTB, NTB, NB mẫu tôm sú hệ gen các quần đàn tôm sú bằng 2. Đa hình AFLP trong các 2. Kỹ thuật AFLP đánh giá quần đàn và giữa các kỹ thuật AFLP. đa hình hệ gen.

quần đàn tôm sú. Cây phát sinh chủng loại. Tạo vật liệu 1. Thu mẫu 4 dòng tôm 1.

Tôm sú bố mẹ sạch nghiên cứu: tôm sú: A, T, G, N bệnh. sú thế hệ Go và 2. Thiết lập các gia đình 2. Tôm sú thế hệ Go, G1 G1 tạo thế hệ Go, G1.

Bộ dữ liệu SNP của 2 1. Tách chiết DNA tôm sú nhóm tôm sú tăng trưởng Go, G1. nhanh và tăng trưởng chậm. Giải trình tự bằng GBS 2.

Hai chỉ thị SNP nằm trong 3. Sàng lọc SNPs vùng exon của gen MHC: 4. Chú giải gen chức Sàng lọc SNPs năng  SNP liên quan đến 5. Xác định tương quan Contig83953:g.20T>C trên tính trạng tăng giữa các contig chứa gen MHCa biến đổi codon trưởng ở tôm sú SNP so với gen MHC AAAAAG, không làm bằng kỹ thuật 6.

Xác định: vùng tương thay đổi acid amin Lysine; GBS. đồng giữa contig chứa  SNP SNP so với gen mã hóa Contig260347:g.19G>A protein MHC, codon chứa trên gen MHC1 biến đổi SNP, vị trí tương ứng của codon GGA (mã hóa acid chỉ thị SNP trên gen MHC amin Glycine)  GAA (mã hóa acid amin Glutamic). Kỹ thuật KASP 1. Thiết kế mồi đặc hiệu dựa trên trình tự chứa dựa trên chỉ thị 28 mẫu đồng hợp tử A:A; SNP G>A của gen MHC.

SNP kiểm tra tôm 2 mẫu đồng hợp tử G:G; G1 tăng trưởng 2. Kiểm tra trên 40 cá thể tôm sú tăng trưởng nhanh 10 mẫu dị hợp tử G:A. thuộc thế hệ G1. 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

TÔM SÚ Penaeus monodon 1. Đặc điểm sinh học, phân loại và phân bố địa lý Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon do Fabricius mô tả và đặt tên năm 1798. Tôm sú là một trong số các loài tôm nuôi quan trọng và được phân loại như sau (Brusca et al., 1990): Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustatacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Natantia Siêu họ: Penaeoidea Họ: Penaeidae Giống: Penaeus Loài: monodon Hình 1. Tôm sú Penaeus monodon (Nguồn: Nguyễn Hữu Ninh, 2012) Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt bụng.

Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ (Hình 1. 6 Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thước lớn (có thể dài đến 270 mm, nặng 260g hoặc lớn hơn) và là loài tôm thương mại quan trọng (Motoh, 1985). Tôm có các bộ phận: chủy (cứng, có răng cưa, phía trên chủy có 7-8 răng, dưới chủy có 3 răng); mũi khứu giác và râu (cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm); 3 cặp chân hàm (lấy thức ăn và bơi lội); 5 cặp chân ngực (lấy thức ăn và bò); cặp chân bụng (rf); đuôi (nhảy xa, điều chỉnh bơi lên cao, xuống thấp); bộ phận sinh dục (Motoh, 1985). Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng về kích thước và khối lượng.

Sau mỗi lần lột xác, cơ thể tôm sú tăng nhanh về kích thước. Quá trình này phụ thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và giai đoạn phát triển của cá thể.