Nghiên cứu sinh khả dụng in vivo của curcumin giải phóng từ màng cellulose vi khuẩn nạp thuốc dùng qua da

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN THỊ THÚY NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG IN VIVO CỦA CURCUMIN GIẢI PHÓNG TỪ MÀNG BACTERIAL CELLULOSE NẠP THUỐC DÙNG QUA DA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phúc Hưng HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Phúc Hưng, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới TS.

Nguyễn Xuân Thành cùng các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, các thầy cô tại Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Một lần nữa em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, cảm ơn gia đình cùng toàn thể các bạn, những người thân, đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và khích lệ em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thúy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này là của chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Phúc Hưng.

Kết quả nghiên cứu không sao chép và không trùng với bất kỳ luận văn nào. Những trích dẫn, kết quả nghiên cứu có trong luận văn lấy từ các công bố chính thức và có ghi chú rõ ràng. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ. Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thúy MỤC LỤC MỞ ĐẦU.

Lý do chọn đề tài. Mục đích nghiên cứu. Nhiệm vụ nghiên cứu .Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .Phương pháp nghiên cứu. Dự kiến đóng góp mới của đề tài.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Vi khuẩn Acetobacter xylinum. Cấu trúc của BC. Tính chất của BC.

Các ứng dụng của BC trong Y học. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da. Một số tính chất hóa lý của curcumin. Hoạt tính sinh học của curcumin.

Tính khả dụng sinh học của curcumin. Dược động học của curcumin. Tình hình nghiên cứu cur trên thế giới và Việt Nam. Phương pháp HPLC.

Đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học in vivo. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu.

Nguyên liệu và hóa chất. Thiết bị và dụng cụ. Phương pháp nghiên cứu. Thiết kế thí nghiệm.

Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu. Các điều kiện phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN.

Xây dựng quy trình phân tích curcumin trong huyết tương thỏ. Chuẩn bị mẫu phân tích. Xử lý mẫu phân tích. Thẩm định quy trình phân tích curcumin trong huyết tương thỏ.

Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng. Xác định độ lặp lại của phương pháp. Xác định độ đúng của phương pháp xây dựng. Quy trình phân tíchcurcumin trong huyết tương thỏ.

Áp dụng quy trình phân tích lượng curcumin trong huyết tương thỏ. Định lượng Curcumin trong huyết tương thỏ sau khi dán BC nạp thuốc và bôi dung dịch cur. Các thông số dược động học của cur. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

55 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Acetobacter xylinum A. xylinum AUC Diện tích dưới đường cong nồng độ- thời gian BC Bacterial cellulose Cl Độ thanh thải Cmax Nồng độ cực đại HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao HQC Mẫu kiểm chứng nồng độ cao LLOQ Giơí hạn dịnh lượng dưới LQC Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp MQC Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình RSD Độ lệch chuẩn tương đối rpm Vòng/ phút SD Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng T1/2 Thời gian bán thải Tmax Thời gian nồng độ cực đại Vd Thể tích phân bố DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các thông số hoá lý của các thành phần curcuminoid. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống.

Tương quan giữa nồng độ và diện tích píc chuẩn Curcumin. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc chuẩn Curcumin. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp. Nồng độ Curcumin trong huyết tương thỏ sau khi dán BC nạp thuốc.

Nồng độ Curcumin trong huyết tương thỏ sau khi bôi dung dịch cur. Các thông số dược động học trên thỏ sau khi đắp BC – cur và bôi cur. Các thông số dược động học sau khi đắp BC – cur và bôi cur. 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1.Cellulose vi khuẩn(x 20 000 lần).

Cellulose thực vật(x 200 lần). Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng. Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [10]. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc chuẩn Curcumin.

Đường cong nồng độ thuốc theo thời gian trong huyết tương thỏ sau khi đắp BC Cur và bôi Cur. Lý do chọn đề tài Curcumin - một hợp chất thiên nhiên, có nhiều trong rễ củ cây Nghệ. Các nghiên cứu in vitro, in vivo và trên lâm sàng đã chứng minh các đặc điểm dược động học, tính an toàn và khả năng cho hiệuquả điều trịvới nhiều loại bệnh của curcumin. Một số khả năng tác dụng khác cũng được nghiên cứu nhiều như: chống viêm, kháng khuẩn, chống bệnh sốt rét, chống ung thư, bảo vệ gan, thận, chống huyết khối, bảo vệ thành tim, chống thấp khớp [3].

Trên in vitro, curcumin có hiệu quả ức chế tăng sinh của các tế bào ung thư buồng trứng, vú, cổ, tuyến tiền liệt, kết tràng, gan, tuyến tuỵ và xương. Về ứng dụng trong thực tiễn, curcumin đã được sử dụng nhiều để hỗ trợ điều trị các bệnh khác nhau như: đục thủy tinh thể, vết thương khó liền, sỏi mật, dị ứng, viêm tụy, viêm loét dạ dày, viêm ruột, sốt, hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải, bệnh vẩy nến, bệnh Alzheimer, xơ cứng bì, suy giáp, xơ nang, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim, loãng xương, bệnh phổi, sốt rét, viêm khớp, bệnh Leishmania, đái tháo đường, bệnh đa xơ cứng, bệnh động kinh, bệnh Parkinson và bệnh ung thư. Hạn chế của curcumin: hấp thu kém, chuyển hoá và thải trừ khỏi cơ thể nhanh nên sinh khả dụng rất thấp [7]. Curcumin là một hợp chất kỵ nước, độ hoà tan ở pH sinh lý rất thấp (khoảng 11 ng/mL).

Curcumin có tốc độ chuyển hoá và thải trừ nhanh, bị thuỷ phân trong môi trường kiềm và phân huỷ khi gặp ánh sáng, nhiệt độ cao và điều kiện oxi hoá. Rất nhiều phương pháp đã được ứng dụng để làm tăng sinh khả dụng của curcumin thông qua làm tăng độ tan, độ ổn định và tính thấm qua màng tế bào bằng các kỹ thuật hoá học, kỹ thuật bào chế phân tử. Tuy nhiên, cho tới nay, vẫn chưa phát triển thành công được một loại thuốc nào từ curcumin có tác dụng như mong đợi trong điều trị lâm sàng [11]. 2 Trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng.

Một trong những vật liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose. Vật liệu này vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác. Trong đó, Bacterial Cellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài. Đây là một loại vật liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ phẩm,.

Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Về mặt tính chất, BC có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước. BC còn là một mạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, giải phóng nước kéo dài.

Đồng thời BC còn có tính xốp, độ ẩm cao, có lực bền cơ học cao. Vì vậy, BC có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống giải phóng thuốc qua da, qua đường miệng và mô - kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh học khác [8],[16],[20],[21],[22],[24],… Xét về tiềm năng làm hệ thống giải phóng thuốc qua da, ngoài những đặc điểm lợi thế trên, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của UV. Đồng thời BC cũng là vật liệu không gây kích ứng da (do có bản chất là saccarit), an toàn cho da [24]. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường.

Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể là lidocaine 3 [48], caffeine [44], diclofenac [45], amoxicillin [42], benzalconium chloride [20] và sulfadiazine bạc [35] cho kết quả tích cực. Các kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có độ bền và trương nở tương tự như da người; hỗ trợ sự phát triển, di chuyển của tế bào da của con người [16],[19],[20]. Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC nạp thuốc là khả năng chữa lành vết thương, đặc tính bảo vệ, không dị ứng với da và khả năng hấp thu dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan. Hầu hết các chế phẩm đắp qua da được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau.

Do đó, một hệ thống nạp thuốc có khả năng giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí [8],[48]. Trong điều trị nhiễm khuẩn trên da không có triệu chứng toàn thân được khuyến cáo tránh sử dụng các chế phẩm kháng sinh thường được dùng rộng rãi toàn thân như penicilin, sulfonamid, streptomycin, gentamicin,. do có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc. Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa các loại kháng sinh bôi trên da.