Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu hệ gen virus cúm A H5N1 phân lập từ gà Hậu Giang - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN QUANG VUI LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN QUANG VUI Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y Mã số: 62 62 50 10 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. LÊ THANH HOÀ 2. NGUYỄN BÁ HIÊN Hà Nội - 2012 I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận án nào trước đây.

Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trích trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc. Nghiên cứu sinh Trần Quang Vui II LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - PGS. Lê Thanh Hòa và TS.

Nguyễn Bá Hiên - những người thầy đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. - Bộ Khoa học và Công nghệ về Nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Thái Lan và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) đã hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị để chúng tôi thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn: - Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. - Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Viện Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã t ạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu.

- Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có đủ thời gian thực hiện luận án. Nguyễn Thị Bích Nga, các anh chị Phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ , hỗ trợ về kỹ thuậ t trong quá trình nghiên cứu. Góp công sức không nhỏ trong việc hoàn thành luận án là người vợ thân yêu - đã đ ộng viên giúp đỡ, gánh vác mọi công việc gia đình đ ể tôi dành thời gian cho nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nghiên cứu sinh Trần Quang Vui III MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA.

VI DANH MỤC CÁC BẢNG. VIII DANH MỤC CÁC HÌNH. XI MỞ ĐẦU. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Đại cương về bệnh cúm gia cầm. 4 ịch sử bệnh cúm gia cầm 1. 4 ịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới 1. 5 ịch cúm gia cầm ở Việt Nam 1.

Nguyên nhân gây b. Cơ chế sinh bệnh. 13 ệu chứng lâm sàng 1. 18 ống bệnh cúm gia cầm 1.

Phòng ch. Sinh học phân tử virus cúm A. 24 ệ gen của virus cúm A 1. Protein của virus - cấu trúc và chức năng.

Cơ chế phân tử quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A 36 1 ức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A. Các phương th. Tiến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1. 42 ự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 1.

Sự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1 ệt vào Vi Nam. Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam. Phản ứng RT-PCR trong nghiên cứu virus cúm A. Một số nghiên cứu về sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam.

50 ã hệ gen virus cúm A/H5N1 1. Tầm quan trọng của việc giải m. 54 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. 56 ải trình tự toàn b ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 2. Gi (CkHG4) ập từ gà Hậu Giang phân l.

Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới. Vật liệu nghiên cứu. 56 ụng cụ và thiết bị 2. 57 ịch và môi trường 2.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp tách chiết RNA tổng số. Phương pháp RT-PCR. 59 2 ểm tra sản phẩm RT.

Phương pháp ki -PCR. 63 2 ạch sản phẩm RT. Phương pháp tinh s -PCR. Phương pháp dòng hóa.

Phương CHƯƠNG pháp 3: KẾT giảiVtrình QUẢ À THẢO LUẬN. Kết 2 quả giải mã hệ gen virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4. Phương ết quả tách RNA tổng số. Kết quả giải trình tự các gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1).

71 3 ải trình tự gen H5 (HA). 71 3 ải tr ự gen N1 (NA). 73 3 ết quả giải trình tự cá. Giải trình t.

75 3 ải trình tự gen PB1. 76 3 ải trình tự gen PA. Phân 3 tíchếtsoquả sánhgiảithành trình tựphần các gen gen, NP,mốiM vàquan hệ nguồn gốc phả hệ của NS. K 79 chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới.

83 3 ải trình 3. 3 Phân tích gen N1. Phân tích gen PB2. ải tr genựPB1 gen NS và PB1-F2.

Phân tích gen PA. Phân tích gen NP. Phân tích gen M. Phân tích gen NS.

Thảo luận chung. 131 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 136 Ã CÔNG B CÁC CÔNG TRÌNH Đ Ố LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

139 PHỤ LỤC VI DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA Ký hiệu Tiếng Anh Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa tiếng Việt Aa Amino acid Axit amin Bp Base pair Cặp bazơ Ck Chicken Gà CkHG4 A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) Chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà Hậu Giang năm 2005 Da Dalton Đơn vị tính trọng lượng phân tử protein Dk Duck Vịt DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng PCR ddNTP dideoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng giải trình tự ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Phản ứng miễn dịch đánh dấu Assay enzym FAO Food and Agricultural Organization Tổ chức nông lương thế giới Gs Goose Ngỗng HA Haemagglutinin Ngưng kết hồng cầu HI Hemagglutination Inhibition Ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao Kb Kilo base Kilo bazơ LB Luria-Bertani Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy vi khuẩn LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp M Matrix Protein đệm MDk Muscovy duck Ngan MEGA Molecular Evolutionary Genetics Chương trình phân tích tiến hóa VII Analysis gen NA Neuraminidase Enzym phân giải sialic NEP Nuclear Export Protein Protein vận chuyển NP Nucleoprotein Protein nhân NS Non structural protein Protein không cấu trúc OIE Office International des Epizooties Tổ chức Thú y thế giới PA Polymerase acidic protein Enzym polymerase có tính axit PB1 Polymerase basic protein 1 Enzym polymerase có tính bazơ 1 PB2 Polymerase basic protein 2 Enzym polymerase có tính bazơ 2 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng PCR RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic RNP Ribonucleoprotein Tổ hợp protein liên kết ribonucleic RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Phản ứng PCR ngược Chain Reaction SPF Specific Pathogen Free Không chứa mầm bệnh (siêu sạch) (-)ssRNA Negative single-strand Ribonucleic ARN sợi đơn âm Acid TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA TNF-α Tumor Necrosis Factor-α Yếu tố α gây hoại tử khối u WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới VIII DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo ừ tháng 12/2003 đến cáo cho WHO t 6/7/2012 6 ần phản ứng RT 2.1 Thành ph -PCR 59 2.2 Chu trình nhiệt sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 60 2.3 Danh sách mồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm 61 ần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự 2.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và ối quan hệ nguồn gốc phả hệ m 85 3.2 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen H5 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 86 3.3 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5 ữa 27 chủng virus cúm gi 87 3.4 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) gen H5 giữa các chủng ủa Việt Nam và thế giới cúm A/H5N1 c 90 3.5 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen N1 trong phân tích so sánh thành phần gen ối quan hệ nguồn gốc phả hệ và m 94 3.6 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen N1 chủng CkHG4 với ủng virus cúm khác 26 ch 95 3.7 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1 giữa 27 chủng virus cúm 96 3.8 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen N1 giữa các ủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới ch 100 IX 3.9 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen PB2 trong phân tích so sánh thành phần ối quan hệ nguồn gốc phả hệ gen và m 102 ủa gen PB2 chủng CkHG4 3.10 So sánh vị trí sai khác nucleotide c ới 26 chủng virus cúm khác v 103 3.11 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2 ữa 27 chủng virus cúm gi 104 3.12 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế ới được sử dụn gi g gen PB1 và PB1-F2 trong phân tích so sánh ần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ thành ph 107 3.13 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB1 chủng CkHG4 ới 26 chủng virus cúm khác v 109 ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptid 3.14 So sánh v e PB1 ữa 27 chủng virus cúm gi 110 ị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen PB1 3.15 So sánh v -F2 ủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác ch 111 3.16 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen PA trong phân tích so sánh thành phần ối quan hệ nguồn gốc phả hệ gen và m 113 3.17 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PA chủng CkHG4 với ủng virus cúm khác 26 ch 115 3.18 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PA ữa 27 chủng virus cúm gi 116 ế 3.