Luận án TS Sinh học: Enterocin P tái tổ hợp ứng dụng bảo quản thực phẩm - Phạm Thùy Linh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------- Phạm Thùy Linh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------- Phạm Thùy Linh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.TS Trương Nam Hải 2. TS Phạm Văn Ty Hà Nội – 2011 MỞ ĐẦU Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Trong 7 tháng đầu năm 2008, đã xảy ra 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 ngƣời mắc và 43 ngƣời đã tử vong. Có nhiều nguyên nhân dẫn tới ngộ độc thực phẩm trong đó nguyên nhân do nhiễm vi sinh vật và các độc tố của chúng chiếm hơn 80%, chủ yếu là do các chủng thuộc loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Clostridium botulinum, C.

perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii và Escherichia coli O157:H7 [53]. Các vi khuẩn này phát triển ngay cả ở nhiệt độ thấp (4-6o C), trong thịt ƣớp lạnh, thịt nguội, phô mai chƣa tiệt trùng. gây ra những rối loạn tiêu hóa, mất cân bằng điện giải, kiệt sức. Trƣờng hợp nặng có thể dẫn đến tử vong nếu không chữa trị đúng cách và kịp thời.

Trong những năm gần đây, tình trạng ngộ độc thực phẩm có liên quan đến L. monocytogenes đã bùng phát tại nhiều nƣớc trên thế giới. Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, Listeria đã đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO) xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. Listeria phân tán rộng rãi trong môi trƣờng đất, nƣớc, phân gia súc nên rất dễ lây nhiễm qua thực phẩm.

Tác hại của loại vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thực phẩm mà chúng còn gây ra các bệnh lý nguy hiểm đặc biệt cho thai phụ nhƣ gây nhiễm trùng phôi thai, sẩy thai, viêm não, nhiễm trùng máu. Một nguyên nhân khác gây ngộ độc thực phẩm là do chính những chất phụ gia bảo quản hoặc chất tạo màu, tạo mùi trong quá trình xử lý, chế biến. Thực phẩm hiện nay đƣợc bảo quản chủ yếu dựa vào các phụ gia tổng hợp hóa học hoặc qua các chu trình xử lý nhiệt độ, áp suất. Điều này khiến ngƣời tiêu dùng lo ngại về những tác động lâu dài có hại đến sức khỏe cũng nhƣ đặt ra yêu cầu ngày càng tăng về độ “tự nhiên”, giảm tối đa quy trình xử lý của thực phẩm.

Bởi vậy, song song với vấn 1 đề vệ sinh an toàn thực phẩm, nhu cầu về phƣơng pháp bảo quản thực phẩm cũng nhƣ các chất bảo quản thực phẩm mới, các chất diệt khuẩn an toàn có nguồn gốc sinh học, không độc hại đối với sức khỏe con ngƣời đang là một nhu cầu cấp thiết ở hầu khắp các nƣớc trên thế giới. Bacteriocin là nhóm các chất hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên Thế giới nhằm đƣa vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Đây là các peptide hoặc protein do vi khuẩn sinh ra, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh và gây hƣ hỏng thực phẩm dù ở nồng độ rất thấp nhƣng lại an toàn đối với ngƣời sử dụng do dễ bị bất hoạt và phân hủy dƣới tác động của các protease trong hệ tiêu hóa. Trong số đó, enterocin P (EntP) đƣợc sinh tổng hợp từ chủng Enterococcus faecium P13, có phổ kháng khuẩn tƣơng đối rộng đối với các vi khuẩn Gram dƣơng gây bệnh thƣờng đƣợc phát hiện trong thực phẩm nhƣ C.

và đặc biệt là L. EntP khá bền nhiệt, có thể đảm bảo hoạt tính sau khi xử lý ở 100 o C trong 60 phút hoặc ở 121o C trong 15 phút. Hoạt tính này ổn định trong một thời gian dài khi đƣợc bảo quản ở - 20o C hoặc 4o C [21]. EntP còn có khả năng hoạt động trong khoảng pH rộng, từ 2 đến 11.

Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn Enterococcus có khả năng sản sinh enterocin lại thƣờng sinh ra các độc tố nên việc lên men, thu hồi enterocin ở dạng sạch, đủ tiêu chuẩn sử dụng trong thực phẩm gặp nhiều khó khăn. Với mục tiêu tổng hợp EntP theo con đƣờng tái tổ hợp nhằm chủ động điều khiển sinh tổng hợp enterocin hiệu suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch sản phẩm, ứng dụng vào bảo quản thực phẩm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”. Công trình đƣợc thực hiện tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và đƣợc hỗ trợ kinh phí thực hiện từ đề tài cấp nhà nƣớc do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ quản “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nisin và enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm”. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BACTERIOCIN Trong quá trình đấu tranh sinh tồn, vi sinh vật thƣờng tiết ra những chất có khả năng kìm hãm, ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật khác có sự cạnh tranh với chúng về nơi sống và nguồn dinh dƣỡng nhƣ các axit hữu cơ, diacetyl, acetoin, peroxide hidro, reuterin, reutericyclin, các peptide kháng nấm. [36, 54, 55, 72], trong số đó phổ biến nhất là bacteriocin. Bacteriocin là peptide hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp, có hoạt tính kháng khuẩn [25, 34, 43].

Bacteriocin đầu tiên đƣợc Gratia phát hiện vào năm 1925 với tên gọi là principe V do một chủng E. coli sinh ra. Năm 1946, Gratia và Fredericq đã đổi tên bacteriocin này thành “colicin”. Thuật ngữ bacteriocin đƣợc Jacob và cộng sự đề xuất từ năm 1953 [17, 86, 87].

Tƣơng tự “ase” sử dụng trong enzyme, tiếp tố “in” hoặc “cin” dùng để biểu thị các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn. Tiếp tố này đƣợc viết thêm vào tên chi hoặc tên loài. Ví dụ, bacteriocin tiết ra từ E. coli đƣợc gọi là colicin, từ Bacillus subtilis đƣợc gọi là subtilin.

Các chữ cái đứng sau tên bacteriocin chỉ thứ tự bacteriocin đƣợc tìm ra ở cùng một loài. Ví dụ, lactacin F là bacteriocin thứ 6 đƣợc tìm ra từ loài thuộc chi Lactobacillus [53]. Bacteriocin đƣợc phát hiện ở hầu hết các loài vi khuẩn, đặc biệt một số loài có khả năng tiết hàng chục bacteriocin khác nhau [86]. Vi khuẩn cổ (Archaea) cũng có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn giống bacteriocin gọi là archaeocin, điển hình là họ halocin sinh ra bởi vi khuẩn cổ thuộc chi Halobacterium [87, 92].

Cho tới nay đã có hàng trăm bacteriocin đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Chúng rất đa dạng về chủng sản sinh, kích thƣớc phân tử, tính chất vật lý hóa học, độ bền, phổ kháng khuẩn và cơ chế tác động [31]. Tập hợp gen cấu trúc và gen điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩn cũng rất đa dạng, có thể nằm trong hệ gen (plantaracin A và sackacin 674), trong plasmid (pediocin) [91], hoặc thậm chí nằm trong các 3 transposon nhƣ nisin đƣợc sinh ra từ L. Mặc dù vậy, cho tới nay, trong số hàng trăm bacteriocin đƣợc phát hiện và nghiên cứu, mới chỉ có nisin là bacteriocin duy nhất đƣợc Tổ chức Nông lƣơng (Food and Agriculture Organization – FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) công nhận là chất bảo quản thực phẩm từ năm 1969 và đƣợc sử dụng rộng rãi tại hơn 50 quốc gia trên Thế giới [17].

Cùng có hoạt tính kháng khuẩn tuy nhiên bacteriocin hoàn toàn khác biệt với chất kháng sinh dùng trong y học. Đa phần các bacteriocin có phổ kháng khuẩn không rộng, chủ yếu ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác có mối quan hệ gần gũi hoặc tƣơng đồng, có sự cạnh tranh trực tiếp về nơi sống và nguồn dinh dƣỡng [67]. So sánh bacteriocin và các kháng sinh dùng trong y tế [25] Đặc tính Bacteriocin Kháng sinh Mục đích ứng dụng Thực phẩm Y tế Tổng hợp Từ ribosom Sản phẩm trao đổi chất bậc 2 Hoạt tính Phổ hẹp Phổ đa da ̣ng Cơ thế tác động tế bào Ảnh hƣởng tới kết cấu màng tế Tùy thuộc phƣơng thức hoạt đích bào động Yêu cầu tƣơng tác Đôi khi cần cắt ngắn phân tử Đích đặc hiệu Phƣơng thức hoạt động Hầu hết là tạo lỗ trên màng tế Màng tế bào hoặc các đích nội bào chất (một số ít có thể ảnh bào hƣởng đến sinh tổng hợp thành tế bào) Độc tính/tác dụng phụ Chƣa thấy Có Trong bối cảnh vi sinh vật kháng thuốc hiện nay, song song với việc phát triển các kháng sinh phổ rộng dùng trong y tế thì việc nghiên cứu những bacteriocin đặc hiệu với nhóm vi khuẩn nhằm đƣa vào ứng dụng cũng đang là một vấn đề đƣợc quan tâm đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe. PHÂN LOẠI BACTERIOCIN Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn đa dạng và phong phú, đƣợc tiết ra bởi 4 nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, đƣơ ̣c chia thành hai nhóm lớn là bacteriocin của vi khuẩn Gram âm và bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng.

Vi khuẩn gram dƣơng có quá trình điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin đặc hiệu, trong khi các bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm đƣợc tổng hợp chỉ phụ thuộc vào hệ thống điều hòa thông thƣờng của tế bào chủ trong những điều kiện bất lợi. Quá trình tiết bacteriocin ở vi khuẩn Gram dƣơng không giết chết bản thân vi khuẩn chủ, trong khi đó bacteriocin của vi khuẩn Gram âm thƣờng đƣợc giải phóng thông qua quá trình tiêu bào [85]. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram âm sản sinh một loạt các bacteriocin rất đa dạng về kích thƣớc và phƣơng thức hoạt động, đƣợc đặt tên theo chi (nhƣ klebicin của Klebsiella pneumoniae) hay theo loài của vi khuẩn sản xuất (nhƣ colicin của E. coli, marcescin của Serratia marcescens, alveicin của Hafnia alvei, cloacin của Enterobacter cloacae.

coli, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc hơn 30 loại bacteriocin. Tuy nhiên, đến nay các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn chƣa đƣợc hoàn toàn sáng tỏ. Việc nghiên cứu những thông tin này là rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các quần thể vi khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên mà còn tìm ra các bacteriocin có đặc tính mới cho nghiên cứu [87].