Luận án tiến sĩ chế tạo và đặc trưng tính chất của tổ hợp carrageenan/collagen mang dược chất allopurinol - Vi Quync Minh

Carrageenan là polysaccharide tuyến tính có chứa nhóm sulfat este hóa. Phân tử gồm các đơn vị D-galactose và 3,6-anhydro-D-galactose liên kết glycosidic α-(1→3) và β-(1→4). Có ba loại chính: kappa (κ), iota (ι) và lambda (λ). Kappa-carrageenan tạo gel cứng với ion K+. Iota-carrageenan tạo gel mềm, đàn hồi với ion Ca2+. Lambda-carrageenan không tạo gel, chỉ tạo dung dịch nhớt. Tảo đỏ Eucheuma cottonii và Kappaphycus alvarezii là nguồn nguyên liệu chính. Quá trình chiết xuất carrageenan sử dụng phương pháp kiềm nóng. Nồng độ KOH, nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Carrageenan có tính tương thích sinh học tốt. Polyme này được FDA công nhận an toàn cho thực phẩm và dược phẩm. Ứng dụng trong hệ phân phối thuốc bao gồm viên nén, viên nang, hạt vi nang và màng sinh học.

Collagen là protein phong phú nhất trong cơ thể động vật. Cấu trúc collagen gồm ba chuỗi polypeptide cuộn xoắn dạng triple helix. Collagen type I chiếm ưu thế trong da, xương và vảy cá. Vảy cá là phụ phẩm ngành thủy sản, chứa 40-60% collagen trọng lượng khô. Chiết xuất collagen từ vảy cá giúp tận dụng nguồn nguyên liệu giá rẻ, thân thiện môi trường. Collagen thủy phân có trọng lượng phân tử thấp hơn collagen nguyên bản. Quá trình thủy phân sử dụng acid, kiềm hoặc enzyme. Collagen thủy phân có độ hòa tan cao, khả năng hấp thu tốt. Tính chất tạo màng, tạo gel của collagen phù hợp cho hệ phân phối thuốc. Collagen từ vảy cá có nhiệt độ biến tính thấp hơn collagen từ bò hoặc lợn. Đặc tính này thuận lợi cho quá trình chế tạo vật liệu mang dược chất nhạy nhiệt. Ứng dụng bao gồm scaffold mô, màng vết thương và hệ phóng thích kiểm soát.

Allopurinol là chất ức chế cạnh tranh enzyme xanthine oxidase. Cơ chế chuyển allopurinol thành oxypurinol ức chế tổng hợp acid uric. Thuốc được chỉ định điều trị tăng acid uric máu nguyên phát và thứ phát. Bệnh gout, sỏi thận acid uric là các bệnh lý liên quan. Sinh khả dụng đường uống của allopurinol đạt 67-90%. Thời gian bán thải ngắn (1-2 giờ) yêu cầu uống nhiều lần mỗi ngày. Điều này gây bất tiện và giảm tuân thủ điều trị của bệnh nhân. Hệ phân phối kiểm soát phóng thích giúp kéo dài thời gian tác dụng. Tổ hợp polyme thiên nhiên là lựa chọn phù hợp mang allopurinol. Carrageenan tương tác ion với allopurinol qua nhóm amino. Collagen bổ sung tính chất cơ học và tạo môi trường sinh học thân thiện. Hệ thống Car/C/ALP hứa hẹn cải thiện hiệu quả điều trị bệnh gout.

Vảy cá tươi được rửa sạch bằng nước cất nhiều lần. Bước xử lý sơ bộ loại bỏ vảy gãy, vụn và tạp chất cơ học. Dung dịch NaOH nồng độ 0,1-0,5 M được sử dụng xử lý kiềm. Thời gian xử lý từ 6 đến 24 giờ ở nhiệt độ 4-25°C. Mục đích loại bỏ protein phi collagen, lipid và sắc tố. Tỷ lệ vảy cá/dung dịch kiềm ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Xử lý kiềm quá mạnh làm suy thoái cấu trúc collagen. Nồng độ và thời gian cần được tối ưu hóa cẩn thận. Sau xử lý, mẫu được rửa bằng nước cất đến pH trung tính. Bước này loại bỏ hoàn toàn dư lượng NaOH trong mẫu. Protein không collagen hòa tan trong môi trường kiềm được tách ra. Collagen chịu được điều kiện kiềm nhẹ nhờ cấu trúc triple helix bền vững.

Sau xử lý kiềm, vảy cá chứa hàm lượng khoáng chất cao. Calcium phosphate chiếm 40-50% trọng lượng khô của vảy cá. Hỗn hợp acid HCl/EDTA được sử dụng cho quá trình khử khoáng. Nồng độ HCl dao động từ 0,1 đến 0,5 M. EDTA nồng độ 0,1-0,5 M hỗ trợ loại bỏ ion kim loại. Thời gian khử khoáng từ 12 đến 72 giờ ở nhiệt độ phòng. Mẫu được khuấy đều để tiếp xúc acid hiệu quả. Sau khử khoáng, mẫu được rửa nước cất đến pH ổn định. Collagen thô được chiết xuất bằng nước ấm 45-60°C hoặc acid acetic loãng. Dịch chiết được lọc và kết tủa bằng NaCl bão hòa. Collagen thu được rửa dialysis去除 muối và đông khô. Kiểm tra hàm lượng hydroxyproline đánh giá độ tinh khiết. SDS-PAGE xác định loại collagen và trọng lượng phân tử chuỗi α.

Collagen từ vảy cá có thành phần acid amin đặc trưng. Glycine chiếm khoảng 30-35% tổng số acid amin. Proline và hydroxyproline chiếm 20-25%. Tỷ lệ hydroxyproline thấp hơn collagen từ động vật có vú. Đặc điểm này giải thích nhiệt độ biến tính thấp hơn của collagen cá. Alanine, glutamic acid và aspart acid là các acid amin phổ biến khác. Phân tích FTIR cho thấy các băng hấp thụ đặc trưng collagen. Băng Amide A ở 3300 cm⁻¹ liên quan nhóm N-H kéo căng. Băng Amide I ở 1650 cm⁻¹ và Amide II ở 1550 cm⁻¹. Kết quả XRD cho thấy đỉnh nhiễu xạ ở 2θ = 7-8° và 20-23°. Đặc trưng này xác nhận cấu trúc triple helix collagen. SDS-PAGE hiển thị các dải α1, α2 và β tương ứng collagen type I.

Dung dịch carrageenan 2% (w/v) được chuẩn bị trong nước cất nóng. Nhiệt độ hòa tan 80°C, khuấy liên tục 30 phút. Dung dịch collagen 2% (w/v) chuẩn bị trong acid acetic 0,5 M. Hai dung dịch trộn theo tỷ lệ Car/C: 100/0, 75/25, 50/50, 25/75, 0/100. Allopurinol (10-30% trọng lượng polyme) thêm vào dung dịch hỗn hợp. Hỗn hợp được khuấy đều tốc độ 300 rpm trong 30 phút. Bọt khí loại bỏ bằng siêu âm hoặc để nghỉ 24 giờ. Dung dịch đổ vào khuôn teflon kích thước 10×10 cm. Sấy ở 40°C trong tủ sấy 24-48 giờ. Màng thu được bóc ra và bảo quản trong desiccator. Kiểm tra độ dày bằng micromet. Độ trong và màu sắc đánh giá bằng mắt thường. Màng mỏng, dẻo, có độ đồng đều cao là tiêu chí đánh giá.

Hạt vi cầu được chế tạo bằng kỹ thuật nhỏ giọt ionotropic gelation. Dung dịch Car/C/ALP được bơm qua kim nhỏ giọt cỡ 22-25G. Tốc độ bơm 1-5 mL/phút kiểm soát kích thước hạt. Dung dịch gel hóa chứa CaCl2 hoặc KCl nồng độ 2-5% (w/v). Khoảng cách từ kim đến bề mặt dung dịch gel hóa 5-10 cm. Giọt polyme tiếp xúc ion kim loại tạo gel ngay lập tức. Hạt được giữ trong dung dịch gel hóa 30-60 phút. Thu hạt bằng lọc, rửa nước cất loại bỏ ion dư. Sấy đông khô hoặc sấy phun thu sản phẩm cuối cùng. Tốc độ nhỏ giọt tăng làm giảm kích thước hạt. Nồng độ ion Ca2+ tăng làm hạt cứng hơn, nhỏ hơn. Tỷ lệ Car/C ảnh hưởng hình dạng và tính chất hạt. Hạt tròn đều, kích thước phân bố hẹp là mục tiêu tối ưu.

Tỷ lệ carrageenan/collagen ảnh hưởng đáng kể tính chất vật liệu. Màng carrageenan nguyên chất có tính chất cơ học tốt nhưng giòn. Thêm collagen cải thiện tính dẻo dai và độ đàn hồi màng. Tỷ lệ Car/C 50/50 cho tính chất cân bằng tốt nhất. Độ bền kéo tăng khi hàm lượng carrageenan tăng. Độ giãn dài tăng khi hàm lượng collagen tăng. Nhiệt độ biến tính thay đổi theo thành phần tổ hợp. DSC cho thấy đỉnh nhiệt riêng biệt cho từng thành phần. Tổ hợp có nhiệt độ biến tính trung gian giữa hai polyme. TGA cho thấy ba giai đoạn phân nhiệt tương ứng. Ổn định nhiệt tổ hợp tốt hơn collagen nguyên chất. Tương tác hydrogen giữa hai polyme cải thiện tính chất vật liệu. FTIR xác nhận tương tác liên phân tử trong tổ hợp.

SEM cho thấy hình thái bề mặt màng tổ hợp khác biệt rõ rệt. Màng carrageenan nguyên chất có bề mặt tương đối nhẵn. Màng collagen có cấu trúc sợi phân bố ngẫu nhiên. Màng tổ hợp Car/C có cấu trúc xen kẽ giữa hai pha. Mặt cắt ngang cho thấy cấu trúc lớp đặc trưng. Bề mặt hạt vi cầu có dạng hình cầu hoặc hình bầu dục. Kích thước hạt dao động từ 500 μm đến 2 mm. DLS đo kích thước hạt trong hệ treo nước cho phép đánh giá phân bố. Đỉnh phân bố kích thước tập trung ở phạm vi 100-500 μm. Chỉ số polydispersity (PDI) dưới 0,5 cho thấy tính đồng nhất cao. Vi cầu có cấu trúc vỏ-lõi với allopurinol phân bố trong lõi. Hình thái vật liệu ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ phóng thích thuốc.

Phổ FTIR của carrageenan cho thấy các băng đặc trưng. Băng S=O stretching ở 1220-1260 cm⁻¹ xác nhận nhóm sulfat. Băng C-O-S ở 845 cm⁻¹ đặc trưng liên kết galactose-4-sulfat. Băng C-O-C ở 930 cm⁻¹ cho thấy 3,6-anhydrogalactose. Phổ FTIR collagen hiển thị Amide A, Amide I, Amide II, Amide III. Băng Amide A ở 3300 cm⁻¹ liên quan nhóm N-H và O-H. Băng Amide I ở 1650 cm⁻¹ cho thấy cấu trúc α-helix. Phổ tổ hợp Car/C/ALP hiển thị tất cả băng của cả hai polyme. Dịch chuyển băng Amide I và S=O cho thấy tương tác hydrogen. Phổ XRD carrageenan cho thấy đỉnh tinh thể ở 2θ = 28°. XRD collagen có đỉnh đặc trưng ở 2θ = 7,8° và 22°. Tổ hợp có đỉnh rộng hơn cho thấy giảm độ tinh thể. Allopurinol có đỉnh ở 2θ = 11,5°, 16,3°, 25,8°.

DSC carrageenan cho thấy đỉnh phân hủy nhiệt ở 220-240°C. DSC collagen có đỉnh biến tính nhiệt (Td) ở 40-60°C. Nhiệt độ biến tính collagen cá thấp hơn collagen bò (65-75°C). Tổ hợp Car/C có hai đỉnh nhiệt tương ứng hai thành phần. Nhiệt độ biến tính collagen tăng trong tổ hợp do tương tác carrageenan. DSC allopurinol nguyên chất có đỉnh nóng chảy ở 350°C. Trong tổ hợp, đỉnh nóng chảy allopurinol giảm hoặc biến mất. Hiện tượng này chứng tỏ allopurinol phân tán phân tử trong polyme. TGA cho thấy ba giai đoạn mất khối lượng chính. Giai đoạn 1 (50-150°C): mất nước tự do và nước liên kết. Giai đoạn 2 (200-350°C): phân hủy polyme chính. Giai đoạn 3 (350-600°C): phân hủy tàn dư carbon. Tổ hợp Car/C/ALP có nhiệt độ phân hủy cao hơn polyme đơn lẻ.

Đường chuẩn allopurinol xây dựng trong dải nồng độ 1-50 μg/mL. Phương pháp UV-Vis đo ở bước sóng λ = 250 nm. HPLC sử dụng cột C18, pha động methanol/water (30:70). Lưu lượng 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 30°C. Đường chuẩn có hệ số tương quan R² > 0,999. Hiệu suất bao tải (EE%) xác định bằng phương pháp gián tiếp. Dung dịch sau chế tạo được ly tâm và đo allopurinol tự do. EE% = (Tổng allopurinol – Allopurinol tự do)/Tổng allopurinol × 100%. EE% dao động từ 60% đến 92% tùy điều kiện chế tạo. EE% tăng khi nồng độ carrageenan tăng do tương tác ion mạnh hơn. EE% cao nhất đạt ở tỷ lệ Car/C 50/50. Nồng độ allopurinol tối ưu 20% trọng lượng polyme cho EE% tốt nhất. Kết quả cho thấy tổ hợp Car/C có khả năng mang allopurinol hiệu quả.

Thí nghiệm phóng thích thực hiện trong 200 mL dung dịch đệm. Nhiệt độ 37°C, tốc độ khuấy 100 rpm. Mẫu lấy ở các thời điểm 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 12; 24; 48 giờ. Nồng độ allopurinol đo bằng HPLC. Tại pH 1,2 (dạ dày): phóng thích nhanh trong 2-4 giờ. Carrageenan hòa tan chậm trong acid do nhóm sulfat proton hóa. Tại pH 6,8 (ruột non): phóng thích kiểm soát trong 12-24 giờ. Collagen bị enzyme protease phân hủy dần giải phóng allopurinol. Tại pH 7,4 (máu): phóng thích kéo dài 24-48 giờ. Tổ hợp ổn định ở pH trung tính, phóng thích theo cơ chế khuếch tán. Tại pH 5,5 (mô viêm): phóng thích tăng do pH acid cục bộ. Cơ chế phù hợp cho điều trị gout tại ổ viêm. Hạt vi cầu cho thời gian phóng thích dài hơn màng mỏng.

Mô hình toán học giúp hiểu cơ chế phóng thích allopurinol. Mô hình zero-order: Mt/M∞ = k₀t. Phóng thích tốc độ không đổi theo thời gian. Mô hình first-order: ln(1-Mt/M∞) = -k₁t. Phóng thích phụ thuộc nồng độ thuốc còn lại. Mô hình Higuchi: Mt/M∞ = kH√t. Phóng thích theo cơ chế khuếch tán từ ma trận rắn. Mô hình Korsmeyer-Peppas: Mt/M∞ = kptⁿ. Chỉ số n xác định cơ chế phóng thích. n = 0,5: khuếch tán Fickian. 0,5 < n < 1: anomalous transport. n = 1: phóng thích không phụ thuộc thời gian (case II transport). Kết quả cho thấy hệ số R² cao nhất với mô hình Korsmeyer-Peppas. Giá trị n dao động 0,45-0,65 cho thấy cơ chế khuếch tán Fickian. Phóng thích kiểm soát bởi quá trình khuếch tán nước vào ma trận. Allopurinol hòa tan và khuếch tán ra ngoài qua mạng polyme.

Độc tính cấp theo OECD Guideline 423. Nhóm chuột 5 con/nhóm, cả đực và cái. Dùng liều đơn 2000 mg/kg trọng lượng cơ thể. Quan sát triệu chứng lâm sàng trong 14 ngày. Cân nặng, lượng thức ăn, nước uống được ghi nhận hàng ngày. Kết quả: không có chuột chết ở liều 2000 mg/kg. Không quan sát triệu chứng bất thường về hành vi. Cân nặng tăng đều trong suốt thời gian thử nghiệm. LD50 > 2000 mg/kg, phân loại an toàn GHS Category 5. Độc tính bán trung diễn theo OECD Guideline 407. Liều lặp 250, 500, 1000 mg/kg/ngày trong 28 ngày. Xét nghiệm máu cuối thử nghiệm đánh giá độc tính. ALT, AST, creatinine, BUN trong giới hạn bình thường. Không có tổn thương mô bệnh học gan, thận, lách. Kết quả chứng minh an toàn khi sử dụng dài hạn.

Mô hình tăng acid uric máu được thiết lập bằng potassium oxalate. Chuột đực Swiss, 8-10 tuần tuổi, 20-25 g. Potassium oxalate tiêm phúc mạc liều 250 mg/kg. Mô hình gây tăng acid uric máu 24 giờ sau tiêm. Xác nhận tăng acid uric bằng xét nghiệm máu. Nồng độ acid uric huyết thanh tăng 2-3 lần so với nhóm chứng. Chuột được chia thành 5 nhóm (n=8): Nhóm 1: Chứng khỏe mạnh (không điều trị). Nhóm 2: Chứng bệnh (tăng acid uric, không điều trị). Nhóm 3: Allopurinol đường uống 10 mg/kg. Nhóm 4: Hạt Car/C/ALP liều thấp 5 mg/kg. Nhóm 5: Hạt Car/C/ALP liều cao 10 mg/kg. Điều trị trong 14 ngày liên tục. Xét nghiệm máu tại ngày 0, 7 và 14. Thu mẫu gan, thận cuối thí nghiệm làm mô bệnh học.

Kết quả cho thấy hiệu quả giảm acid uric rõ rệt của hạt Car/C/ALP. Nhóm chứng bệnh: acid uric tăng liên tục trong 14 ngày. Nhóm allopurinol uống: acid uric giảm nhanh nhưng dao động. Nhóm hạt Car/C/ALP liều thấp: acid uric giảm từ ngày 7. Nhóm hạt Car/C/ALP liều cao: acid uric giảm tương đương allopurinol uống. Ưu điểm chính là hiệu quả kéo dài và ổn định hơn. Không cần uống nhiều lần mỗi ngày như allopurinol viên nén. Acid uric huyết thanh nhóm Car/C/ALP ổn định hơn nhóm uống. Chỉ số ALT, AST, creatinine không thay đổi đáng kể. Mô bệnh học gan, thận không có tổn thương. Kết quả chứng minh tiềm năng ứng dụng điều trị gout mạn tính. Hệ phân phối Car/C/ALP cải thiện tuân thủ điều trị của bệnh nhân. Nghiên cứu lâm sàng cần được thực hiện đánh giá an toàn và hiệu quả trên người.