Luận án Tiến sĩ Vương Bảo Thy: Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA VƯƠNG BẢO THY LUAN AN TIEN SY KY THUAT TP. HO CHI MINH, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA VƯƠNG BẢO THY NGHIÊN CUU THU NHAN ENZYME TIỂU HÓA TU NOI TANG CA TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) Chuyên ngành: Chế Biến Thực Pham va Đô Uống Mã số: 62540201 Phản biện độc lập 1: GS.

ĐẶNG THỊ THU Phản biện độc lập 2: PGS. TRANG SĨ TRƯNG Phản biện 1: GS. TRAN THỊ LUYEN Phan bién 2: PGS. DONG THI THANH THU Phan bién 3: PGS.LE VAN VIET MAN NGUOI HUONG DAN KHOA HOC 1.

TRAN BICH LAM 2. LUU DUAN Tp. Hồ Chí Minh — 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án Vương Bảo Thy LOI CẢM ON Ngành công nghiệp enzyme phát triển ngày càng mạnh, mở ra những cơ hội và thách thức lớn, đặc biệt là enzyme từ nguôn phế liệu nội tạng ngành chế biến cá tra ở nước ta. Trước hiện trạng đó, vấn dé nghiên cứu cấp thiết được đặt ra và sau không it những khó khăn, trở ngại nhưng với sự nỗ lực cua bản thân cùng sự hồ trợ của Thầy Cô, gia đình, dong nghiệp và bạn bè, luận án đã hoàn thành. Tôi xin gửi lời tri ân sấu sắc đến Thay, Cô hướng dan khoa học là TS. Tran Bich Lam và GS.

Lưu Duẩn — những người đã tan tình hướng dân, định hướng và hồ trợ tôi rất nhiều từ những ngày dau tiên thực hiện dé tài cho đến tận ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cam ơn Ban Giam Hiệu Trưởng Đại Học Cuu Long- nơi toi dang công tac giảng dạy- đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tai. Tôi xin gửi lòng biết ơn đến quý Thay, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Bộ môn Công nghệ sinh học trường Dai Học Bách Khoa TP.HCM- Quy Thay, Cô trong Bộ môn Sinh hóa, phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học trưởng Dai học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM- Quý Thay, Cô Bo môn Công nghệ thực phẩm trường Đại Hoc Can Thơ luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm thí nghiệm với điều kiện tốt nhất. Tôi sẽ luôn nhớ ơn Ban Giảm Đốc Công ty TNHH Thủy San Hùng Vuong- Vinh Long, các anh chị phòng KCS — đã nhiệt tình hỗ trợ tôi toàn bộ nguyên liệu thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như tỉnh thân hợp tác triển khai nghiên cứu ung dụng tại nhà máy.

Xin cảm ơn các bạn động nghiệp- Thay, Cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm Truong Dai học Cứu Long, Đại học Công nghệ Sài Gòn cùng bạn bè đã hỗ trợ tôi rất nhiều frong suốt thời gian thực hiện luận an. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến gia đình và ba mẹ - chính gia đình là nguôn động lực giúp tôi kiên trì vượt qua mọi khó khăn, quyết tâm hoàn thành luận án. Luận án này là món quà vô giá tôi xin trân trọng dành tặng cho Gia đình, Thay Cô — những người luôn yêu thương, bên cạnh tôi trong cuộc sống cũng như trong sự nghiệp. TPHCM, ngày 15 tháng 0Ì năm 2015 VƯƠNG BẢO THY TÓM TẮT LUẬN ÁN Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những sản phẩm thủy sản xuất khẩu chủ lực của nước ta.

Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam) đến năm 2020 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8 triệu tan thì riêng phan nội tang cá tra ước tính khoảng 100.000 tân/năm, đây là nguôn nguyên liệu dôi dào, nhiêu tiêm năng đê thu nhận các enzyme tiêu hóa. Do đó, luận án “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus)” đã được thực hiện nhằm xác định đặc điểm phân bó, tính chất của các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra và đề xuất phương pháp chiết tach, tinh sạch, tạo chế phẩm enzyme có giá trị sử dụng cao từ phế liệu. Nghiên cứu đã đúc kết được những kêt quả mới như sau: l- Phân tích enzyme trong các cơ quan nội tang của cá tra xác định rang các enzyme tiêu hóa tập trung nhiều nhất ở gan tụy với hoạt độ lipase 674.02 U/g chất khô, protease 84,28 U/g chất khô va amylase 419,69 U/g chất khô. Điều kiện tốt nhất dé trích ly enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra: ty lệ nguyên liệu/dung môi 1/2(w/v) voi dung môi trích ly là dung dịch đệm Tris-HCl 0,05N, pH8, nhiệt độ 5°C, thời gian 1 giờ.

Sử dụng phương pháp lọc màng có thể thu nhận chế phẩm lipase từ gan tụy cá tra theo qui trình: lần lượt lọc dịch trích enzyme qua mang MF lum và 0.1um, lọc màng UF 10 kDa dé thu enzyme với tỷ lệ pha loãng dich enzyme thô 1/3, áp suất lọc 6 psi, thời gian lọc 120 phút. Hiệu suất thu hồi lipase sau lọc UF 90,6%, độ tinh sạch 2,07 lần. Chế phẩm có hoạt độ lipase: 22,22 U/ml, hoạt tính riêng lipase: 52,70 U/mg protein. Đề sản xuất chế phẩm enzyme, tốt nhất là sử dung phương pháp kết tua bằng ethanol theo ty lệ với dịch trích enzyme là 3/1 (v/v).

Chế phẩm có hoạt độ lipase: 587,85 U/g, hoạt độ riêng lipase: 16,91 U/mg protein, hoạt độ protease: 49,26 U/g, hoạt độ riêng protease 1,42 U/mg protein. Hiệu suất thu nhận chế phẩm 8,3% so với nguyên liệu ban đầu (w/w). Đã dé xuất phương pháp tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra: từ dịch trích ly enzyme thô, kết tủa enzyme bang muối amoni sunfate 60% bão hòa, thâm tích bang màng cellophane 12 kDa loại muối. Dùng cột sắc ký trao đối ion DEAE-cellulose thu phân đoạn chứa hai enzyme protease va lipase.

Tach riéng protease va lipase qua sac ky loc gel Sephadex G-75. Protease tinh sạch có hoạt độ riêng 28,59 U/mg protein, độ tinh sạch 22,41 lần, hiệu suất thu hồi 23,67%. Lipase tinh sạch có hoạt độ riêng 509,71 U/mg protein, độ tinh sạch 37,95 lần, hiệu suất thu hồi 40,08%. 6- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của profease từ gan tụy cá tra: là một serine protease có phân tử lượng 31 kDa, có tỷ lệ cao cua serine, aspartic va glutamic, pH tối ưu 8,5, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 55°C, kích thích khi có mặt ion CaTM* và bị kìm hãm bởi các ion Cu, Zn, với cơ chất BSA có Km = 897mg/L và Vinax= 15,7 mg/L.

7- Đã xác định được đặc điểm cấu tao và tinh chất của lipase từ gan tụy cá tra: là một lipase có hoạt độ cao và ồn định, phân tử lượng 57 kDa, có tỷ lệ cao nhất là aspartic va glutamic, pH tối ưu 8, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 50°C, tăng hoạt độ khi có mặt ion Ca”” và bị kìm hãm bởi các ion Cd””,Zn””, hoạt động tốt nhất ở nông độ muối mật NaTC 0,015M, thủy phân liên kết ester vị trí 1,3 của glyceride, với cơ chất triolein có Ky = 1,381 mg/L và Vinax = 0,063 mg/L. 8- Chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra có khả năng ứng dụng san xuất pepton trên cơ chất thịt bò và cá thác lác, đạt ty lệ Namin/ Nung lần lượt là 22,15% và 20,97%, đạt yêu cầu của loại pepton-pancreatic (theo Dược điển Việt Nam); chế phẩm enzyme từ gan tụy cá có đặc tính thủy phân các loại protein và chất béo tương đương pancreatin từ tụy lợn nên có thể sử dụng làm dược liệu bào chế thuốc hoặc ứng dụng trong phòng chống suy dinh dưỡng ở trẻ em. Nghiên cứu đã đóng góp dẫn liệu khoa học về hệ enzyme tuyến tụy cá tra (Pangasius hypophthalmus) đồng thời góp phần giải quyết thực tế sản xuất của ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu cá. Kết quả nghiên cứu là đóng góp lý thuyết và thực tiễn cho ngành công nghiệp thủy sản của Việt Nam.

MỤC LỤC MỤC LỤC. TH Họ | DANH MỤC CAC CHỮ VIET TAT .----5- 2 c+c+EsErkererkerered IV DANH MỤC BẢÁNG.---- 5 S1 121 1 12 11111112111111 110121110111 01 20711011111 0g V DANH MỤC HÌNH. | CHƯƠNG 1: TONG QUAN. - - - St SxSxSS SE E1 1H vn rời 4 1.1 Hệ enzyme tiêu hóa .-- - - -- G1111 ng ng re 4 INNNv 9.3 Tình hình nghiên cứu về enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn.4 Ngu6n enzyme tiêu hóa tiềm năng từ cá tra.2 Phé liệu nội tang- nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng _.2 Phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme tiêu hóa .1 Phương pháp thu nhận enzyme bang kỹ thuật kết tủa_.2 Phương pháp thu nhận enzyme băng công nghệ lọc màng .3 Phương pháp trích ly va tinh sạch enzyme tiêu hóa từ nội tang cá.3 Ung dụng của các enzyme tiêu hóa.1 Ứng dụng chế phâm hỗn hợp da enzyme .2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá.

27 CHUONG 2: DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨCU.1 Đối tượng nghiên cứu.-----¿ ¿©5255 1 123v E2 SE rrrrrrgưyg 32 2.2 Phương pháp nghiền CỨU.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm phân bố các enzyme trong nội tạng cá tra (Pangasius hypOphthamus) .ss<c SH rke 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu trích ly enzyme từ nội tang cá tra.3 Phương pháp nghiên cứu thu nhận enzyme bằng kỹ thuật lọc màng .4 Phương pháp nghiên cứu thu nhận enzyme bang kỹ thuật kết tua .5 Phương pháp nghiên cứu tinh sạch enzyme băng kỹ thuật sắc ký.6 Phương pháp xác định một số tính chất của protease gan tuy .7 Phương pháp xác định một số tinh chat của lipase gan tụy .8 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme.3 Các phương pháp phan tích. --- (SH ng re, 43 2.4 Công thức tính toán .-- HH ng HH re 45 2.5 Phương pháp xử lý số liệu.-------- E25 + SE cxsxrrerererered 45 CHUONG 3: KET QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.1 Khao sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá fra.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phan trong nội tạng cá tra.2 Sự phân bố của lipase, protease va amylase trong các cơ quan nội tạng ¬.2 Khao sát quá trình trích ly thu nhận dich enzyme tho .1 Ảnh hưởng của ty lệ nguyên liệu/dung môi trích ly .2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích Ly veces esescsesssseseessesseseseeeeen 54 3.3 Ảnh hưởng của thời gian trích Ly .----- ¿+ ss+c+ce+x+xeeszxexerscxee 56 3.3 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc màng .1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu hồi va độ tinh sạch lipase sau lọc Í.9 ng ng vn 64 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UE.