Luận án tách tinh chế glucomannan từ nưa Amorphophallus konjac (Lâm Đồng) và ứng dụng hạ đường huyết - Trần Thị Nữ (2019)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K. KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2020 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K. KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số:9.14 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. ĐỖ TRƯỜNG THIỆN 2.

TRẦN THỊ Ý NHI Hà Nội, 2020 luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PSG. Đỗ Trường Thiện và TS. Trần Thị Ý Nhi. Các số liệu, kết quả nêu trong tài liệu này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả Trần Thị Nữ luan an LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.Đỗ Trường Thiện, TS. Trần Thị Ý Nhi, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Đặc biệt em xin cảm ơn ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, các phòng ban, các thầy cô tại học viện. Ban lãnh đạo viện Hóa học, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại Viện Hóa học đã tận tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhân dịp này em xin được chân thành cảm ơn đến các anh chị em, bạn bè đồng nghiệp phòng Polyme Thiên nhiên – Viện Hóa học đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu.

Cảm ơn các bạn đồng nghiệp, bạn bè, gia đình đã động viên, khích lệ và giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019 Tác giả Trần Thị Nữ luan an MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT. DANH MỤC CÁC BẢNG.

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ. Giới thiệu chung về glucomannan.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan. Tính chất vật lý của glucomannan. Tính chất hóa học của glucomannan.

Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của glucomannan.Koch và quy trình tách chiết glucomannang. Cây Nưa Amorphophallus Konjac K. Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A. Phản ứng cắt mạch glucomannan.

Cắt mạch bằng các phương pháp lý -hóa học. Thủy phân với xúc tác enzym. Đặc điểm của xúc tác enzym.Các hệ enzym thủy phân mannan. Nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng enzym.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym. Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện phản ứng tối ưu. Enzym AMPK và vai trò của nó trong hạ đường huyết. Quá trình chuyển hóa glucose trong cơ thể.

Quá trình hấp thu glucose. Quá trình chuyển hóa glucose. Khái quát về enzym Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase (AMPK). Các phương pháp hoạt hóa AMPK.

hoạt hóa AMPK bằng vận động. hoạt hóa AMPK bằng hoạt chất. Tính hình nghiên cứu glucomannan từ cây nưa A.konjac tại Việt Nam. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Nguyên liệu và hóa chất. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu. Tách, tinh chế và xác định cấu trúc, tính chất của glucomannan từ cây A.

Tách glucomannan từ cây A. Xác định hàm lượng glucomannan trong bột konjac glucomannan. Xác định cấu trúc và đặc trưng của glucomannan. Thủy phân glucomannan.

Thủy phân bằng axit. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của LKGM-E trên in vitro. Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo.59 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.

Nghiên cứu tách, tinh chế và đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannan trong củ nưa A. Tách và tinh chế glucomannan từ củ Nưa A. Hàm lượng glucomannan trong củ Nưa A.Tách glucomannan từ củ Nưa A. Tinh chế glucomannan.

Đặc trưng cấu trúc, tính chất của glucomannan từ củ A. Phổ IR của glucomannan. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Tính chất nhiệt của KGM.

Khối lượng phân tử của KGM. Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM. Thủy phân glucomannan bằng xúc tác axit HCl. Nghiên cứu điều kiện thích hợp của phản ứng thủy phân xúc tác axit.

Cấu trúc và tính chất của sản phẩm thủy phân. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-1. Phổ IR của LKGM-1. Phổ NMR của LKGM-1.

Tính chất nhiệt của LKGM-1. Khối lượng trung bình của LKGM-1. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym. Định tính khả năng phân huỷ glucomannan của các enzym từ vi khuẩn.

Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng90 3. Kết quả theo mô hình thực nghiệm. Phân tích thống kê. Tìm chế độ thủy phân tối ưu.

Đặc điểm cấu trúc và tính chất của LKGM-E. Phổ IR của LKGM-E. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của LKGM-E. Tính chất nhiệt của LKGM-E.

Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-E. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vitro.

Tác dụng ức chế dung nạp glucose huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo109 KẾT LUẬN CHUNG. 114 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ.116 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 117 luan an DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A. konjac Amorphophallus konjac K.

Koch ADP Adenosine diphotphat AMP Adenosine monophotphat Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein AMPK kinase ATP Adenosine triphotphat DA Độ axetyl hóa DMF Dimetyl Fomamide DMSO Dimethyl sulfoxit DMEM Môi trường cơ bản nuôi cấy tế bào DLS Thiết bị phân tích kích thước hạt DRS Tổng hàm lượng đường khử DSC Phân tích nhiệt quét vi sai E Enzym EC 3.25 exo-β- mannosidase EC 3.78 endo-β-mannanase FBS Huyết thanh thai bò GH họ enzym glycosyl hydrolase GM Glucomannan HPGPC Sắc kí thẩm thấu gel hiệu năng cao HRP Enzym Horseradish peroxidase HS Huyết thanh ngựa KGM Konjac glucomannan IR Phổ hồng ngoại LDK Sản phẩm thủy phân luan an LKGM-1 Konjac glucomannan thủy phân bằng axit LKGM-E Konjac glucomannan thủy phân bằng enzym NAD Nicotinamid adenin dinucleotid NADH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid NADP Nicotinamid adenin dinucleotid photphat NADPH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid photphat NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OGTT Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống PPAR Peroxisom proliferator S Cơ chất (Substrate) SDS Sodium dodecyl sulfat TCA tricarbocylic acid TBS-T Tri Buffer saline T Ween 20 TZD Thiazolidinedion UV Phổ tử ngoại XRD Quang phổ nhiễu xạ tia X luan an DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Hệ sinh vật phân huỷ mannan. Đặc điểm của β-mannanase sinh ra từ một số vi sinh vật. Số thí nghiệm của kế hoạch bậc hai Box – Behnken.

Các mức của các yếu tố ảnh hưởng. Ma trận kế hoạch bậc 2 Box – Behnken cho trường hợp k = 4. Hàm lượng nước trong củ Nưa A. Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn glucose.

Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A. Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) của KGM. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) của KGM.

Kết quả phân tích TGA của KGM. Kết quả đo áp suất thẩm thấu của KGM. Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM. Tổng hợp đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannnan từ củ A.

Ảnh hưởng của nồng độ axit đến hiệu suất và độ nhớt của sản phẩm. Ảnh hưởng của tỉ lệ KGM/dd axít đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng và độ thu hồi sản phẩm. Độ tan và hiệu suất thu hồi sản phẩm. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) trong LKGM-1.

Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) trong LKGM-1. Kết quả phân tích TGA của LKGM-1. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân.88 luan an Bảng 3. Đường kính vòng phân giải glucomannan.

Kết quả thực nghiệm theo kế hoạch Box Behnken. Kết quả phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản ứng thủy phân. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm. Kết quả tính tìm điều kiện tối ưu.

1H NMR độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của LKGM-E. Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR (δ ppm) của LKGM-E trong D2O101 Bảng 3. Kết quả phân tích TGA của LKGM-E. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân bằng enzym.

Độ tan và các tính chất của Konjac glucomannan và sản phẩm thủy phân105 Bảng 3. Tỷ lệ biểu hiện p-AMPK/ β-actin. Glucose huyết ban đầu và sau khi uống glucose.110 luan an DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. Cấu trúc hóa học của glucomannan.

Hình ảnh cây và củ Nưa A.konjac được trồng thử nghiệm tại Lâm Đồng 12 Hình 1. Cấu trúc của một số loại β,1–4 mannan/heteromannan. Cấu trúc phân tử ATP và AMP. Hình ảnh củ Konjac được gọt vỏ và thái lát.

Đường chuẩn glucose. Hình ảnh bột glucomannan thu được sau khi sấy. Quá trình tách tinh bột và tạp chất trong bột KGM. Phổ IR của KGM.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR của KGM. Phổ 13C-NMR của KGM. Phổ 13C-NMR của KGM. phổ HSQC của KGM.

Giản đồ phân tích nhiệt của KGM. Giản đồ nhiễu xạ tia X của KGM. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ C và Π/C của KGM. Ảnh hưởng của nồng độ axit đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân glucomannan. Ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng thủy phân glucomannan. Phổ IR của LKGM-1. Phổ 1H -NMR của LKGM-1.

Phổ 13C-NMR của LKGM-1. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-1. 87 luan an Hình 3. Mối quan hệ giữa nồng độ và áp suất thẩm thấu của LKGM-1.

Vòng phân giải glucomannan của vi khuẩn Bacillus subtilis (A) và mẫu chứng (B). Biến đổi độ nhớt của hỗn hợp phản ứng theo thời gian. Đường mức và đáp ứng bề mặt 3D ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng. Phổ IR của LKGM-E.

Phổ 1H-NMR của LKGM-E ở 80oC trong D2O. Phổ 13C-NMR của LKGM-E ở 80 oC trong D2O. Phổ 1H-13C-NMR-HSQC của LKGM-E ở 80 oC trong D2O. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-E.

Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ (C) và Π/C của LKGM-E 104 Hình 3. Số lần tăng mức độ biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ với mẫu thử so với lô chứng. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau cho uống glucose so với thời điểm ban đầu.