Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD) là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai. Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ, biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [146].

DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau. Đây là gen lớn nhất của người được phát hiện cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA 14kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin.

Protein này có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109]. Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định. Dạng đột biến mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60%.

Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn, khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy đột biến mất đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến mất đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho 19-25 exon trong vùng hay xảy ra mất đoạn [7], [20], [69].

2 Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD. Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến mất đoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biến trong 2 vùng trọng điểm [1], [7], [10]. Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rải rác khắp 79 exon. Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ở những exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền mRNA.

Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằng phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phải khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩa phải khuếch đại toàn bộ 79 exon để xác định đột biến. Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ với các intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNA người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon. Điều này gây tốn kém cả về tài chính lẫn thời gian. Ngược lại, ở cấu trúc của mRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau.

Do vậy, để khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon này, người ta chỉ cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả chiều dài đoạn gen dystrophin [9], [77], [129]. Như vậy, việc xác định đột biến ở mức độ RNA giúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa chất. Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tử vong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặng của gia đình cũng như của cộng đồng. Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bệnh nhân DMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến mới phát sinh [66].

Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán 3 trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường và phòng bệnh bằng phương pháp phá thai chủ động là sự lựa chọn được nhiều người đồng thuận, từ đó có thể giảm tỉ lệ mắc bệnh DMD trong cộng đồng [93], [107]. Ở Việt Nam, năm 1996, Nguyễn Thị Trang và CS nghiên cứu về lâm sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoán người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Trong một nghiên cứu khác, năm 2006, Nguyễn Văn Quyệt cho rằng, phối hợp giữa phân tích phả hệ và định lượng hoạt độ CK có thể phát hiện được 50% bà mẹ dị hợp tử [16]. Tuy nhiên, những kết quả trên chỉ mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền.

Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xác định đột biến mất đoạn gen trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA. Chẩn đoán người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong gia đình bệnh nhân đã được xác định đột biến mất đoạn gen ở trên. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những bà mẹ dị hợp tử.

4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD - Tháng 12-1851, Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả chi tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Ông cho rằng nguyên nhân của bệnh là do giảm các yếu tố dinh dưỡng [49]. - Năm 1861, Duchenne, một nhà thần kinh học người Pháp đã có công mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai.

Năm 1868, Duchenne thực hiện một nghiên cứu quy mô về bệnh lý này, ông đưa ra những tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh dựa trên kết quả giải phẫu bệnh và kích thích điện. Duchenne nhận thấy có sự thay thế mô cơ bằng những mô xơ hoặc mô liên kết trên tiêu bản sinh thiết cơ. Sau đó ông đã sử dụng thủy trị liệu kết hợp với xoa bóp để điều trị cho bệnh nhân và nhận thấy có sự cải thiện bệnh ở một số bệnh nhân. Chính nhờ sự phát hiện quan trọng này mà sau đó bệnh được mang tên ông [34].

- Năm 1879, Gowers đã thu thập bệnh án 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹ lưỡng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết. Ông cũng phát hiện một phụ nữ có những đứa con trai khác cha cùng bị bệnh. Gowers nhận thấy rằng các trẻ mắc bệnh có một đặc điểm giống nhau khi thay đổi tư thế từ nằm sang đứng. Từ đó, dấu hiệu này được xem là dấu hiệu điển hình của bệnh DMD và được mang tên ông: dấu hiệu Gowers [62].

- Nếu tính từ thời Meryon thì bệnh DMD đã được biết hơn 150 năm. Tuy nhiên, trong suốt một thời gian dài, bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và điều trị chỉ tập trung vào chăm sóc hỗ trợ trong quá trình của bệnh [140]. 5 - Trong những năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym CK, phục vụ cho điều trị và tư vấn di truyền [58], [102]. - Năm 1981, Zatz và CS đã phát hiện ra gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21.1 nhờ quan sát những trẻ gái mắc bệnh DMD.

Những bệnh nhân nữ này mang chuyển đoạn giữa NST X và NST thường [140]. - Năm 1984-1987, Hoffman và CS đã phát hiện ra gen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen này [38], [65]. - Những năm sau 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di truyền phân tử phát triển mạnh giúp việc phát hiện đột biến gen dystrophin, tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư vấn di truyền nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ bị bệnh DMD [29], [38]. - Năm 1987-1988, các nhà nghiên cứu cho biết gen dystrophin gồm 60 exon.

- Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb [47]. - Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb [106], [112]. - Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng nề do bệnh gây ra [92], [109]. Đặc điểm của bệnh DMD 1.

Biểu hiện lâm sàng của DMD Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp ngã nhưng chưa có biểu hiện teo cơ. 6 - Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệu Gowers rõ. Khi trẻ đang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốn ngồi dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống nạng đỡ lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lần lượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các động tác như vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến.

- Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi. Sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được. Cuối cùng trẻ thường tử vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96]. Xét nghiệm cận lâm sàng 1.

Định lượng hoạt độ CK toàn phần CK được Lohman phát hiện vào năm 1934. CK là enzym xúc tác sự tạo năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ.