Luận án tiến sĩ nghiên cứu đột biến gen rb1 và mối liên quan đến đặc điểm lâm sà

1 ĐẶT VẤN ĐỀ U nguyên bào võng mạc (Retinoblastoma) là khối u thuộc nhóm u nguyên bào thần kinh (neuroblastoma). Đây là khối u nguyên phát, ác tính ở nội nhãn gặp ở trẻ em sau sinh, với tỷ lệ chiếm khoảng 3% trong tất cả các khối u ở trẻ em [1]. Tế bào u phát sinh từ tế bào tiền thân của tế bào nón trên võng mạc [2]. Phần lớn trường hợp xảy ra ở một bên mắt, có khoảng 25 – 30% trường hợp là bị cả hai bên.

Với tỷ lệ là 1/15000 hay 1/18000 trẻ sơ sinh còn sống [3],[4],[5],[6]. Bệnh u nguyên bào võng mạc (UNBVM) do đột biến gen RB1 trên NST 13 gây nên, đây là gen ức chế khối u đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu, gen đột biến gây mất chức năng cả hai alen làm ProteinRB mất chức năng và tế bào võng mạc tăng sinh không kiểm soát tạo khối u gây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng ở mắt, các triệu chứng của khối u nội nhãn này ngày càng tiến triển nặng dần nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời sẽ xâm lấn và di căn gây tử vong cho bệnh nhân [7],[8],[9],[10]. Đã hơn 200 năm kể từ khi James Wardrop mô tả bệnh u nguyên bào võng mạc, ngày nay là một bệnh có thể điều trị được với tỉ lệ sống sót hơn 95% ở các nước phát triển [11]. UNBVM gây tử vong với tỷ lệ từ 40% đến 70% ở các nước đang phát triển [12],[13].

Hầu hết các ca tử vong do UNBVM xảy ra ở Châu Á và Châu Phi. Chẩn đoán sớm, điều trị kịp thời là yếu tố quyết định sự sống còn của trẻ, giúp cứu vãn thị lực, bảo tồn mắt bị bệnh [11],[14],[15] và tỷ lệ sống từ 88% đến hơn 95% các trường hợp bị bệnh [5],[16]. UNBVM xuất hiện bao gồm ở cả hai dạng di truyền và không di truyền. Hiện nay để chẩn đoán xác định bệnh dựa vào các triệu chứng lâm sàng khi soi đáy mắt kết hợp với chẩn đoán hình ảnh, chỉ làm xét nghiệm giải phẫu bệnh khi cắt bỏ nhãn cầu ở bệnh giai đoạn muộn.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 Y học hiện đại đã có những bước tiến vượt bậc trong những thập gần đây, sau khi các nhà Khoa học giải mã bộ gen người, cơ chế bệnh sinh dần dần được nghiên cứu sâu và làm sáng tỏ ở mức độ phân tử, tạo tiền đề cho việc tìm nguyên nhân gây bệnh, chẩn đoán chính xác và điều trị can thiệp trúng đích nhằm giải quyết tận gốc căn nguyên của bệnh. Năm 1993 Kary Mullis phát minh ra kỹ thuật PCR và được trao giải Nobel về Hóa học, từ đó kỹ thuật khuếch đại chuỗi nhanh chóng được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học phân tử. Những tiến bộ của ngành sinh học phân tử đã sàng lọc phát hiện đột biến gen RB1 trên bệnh nhân và gia đình bệnh nhân giúp chẩn đoán sớm, phát hiện người lành mang gen và chẩn đoán trước sinh nhằm ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh. Bên cạnh đó, xác định mối liên quan đột biến gen RB1 với các đặc điểm lâm sàng sẽ giúp cho tiên lượng bệnh và có liệu trình điều trị chính xác và hiệu quả hơn cũng như phòng bệnh cho các thành viên gia đình và dòng họ.

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về xác định đột biến gen RB1 và mối liên quan với lâm sàng bệnh UNBVM. Ở Việt Nam các nghiên cứu trên bệnh UNBVM trước đây chỉ mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, điều trị tại mắt. Trong vài năm trở lại đây nghiên cứu về phát hiện đột biến gen RB1 đã bắt đầu được triển khai, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào phân tích mối liên quan giữa kiểu gen với lâm sàng bệnh UNBVM để tiên lượng, liệu trình điều trị chính xác, hiệu quả cũng như phòng bệnh, tư vấn di truyền, do đó đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen RB1 và mối liên quan đến đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân U nguyên bào võng mạc” được thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân u nguyên bào võng mạc.

Phân tích đột biến gen RB1 và mối liên quan đến đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm bệnh u nguyên bào võng mạc 1. Lịch sử nghiên cứu bệnh UNBVM Năm 1597, Peter Pawius người Hà Lan lần đầu tiên mô tả về một khối u nội nhãn, một khối u ác tính xâm lấn vào hốc mắt, vùng thái dương và nội sọ.

Năm 1809, James Wardrop người Scotland mô tả bệnh cảnh lâm sàng đầy đủ của bệnh và cho rằng khối u phát sinh từ võng mạc, dựa trên nghiên cứu mô bệnh học phát hiện sự xâm lấn của khối u tới thần kinh thị và vào trong não và sau đó ông mô tả sự di căn của khối u này đến các cơ quan khác nhau của cơ thể. Flexner vào năm 1891 và Wintersteiner vào năm 1897 báo cáo sự giống nhau của các tế bào khối u hình hoa hồng với các tế bào cảm thụ ánh sáng của võng mạc trưởng thành. Ngày nay sự hình thành tế bào này đã được gọi là biến dạng Flexner Wintersteiner. Năm 1920 Verhoeff đề xuất tên bệnh “U nguyên bào võng mạc”, thuật ngữ này đã được thông qua bởi Hiệp hội Nhãn khoa Hoa Kỳ năm 1926.

Năm 2005 một hệ thống phân loại mới áp dụng trên toàn thế giới gọi là ICRB, mục đích giúp ích cho hóa trị liệu toàn thân kết hợp và liệu pháp điều trị tại chỗ, ICRB trở thành hệ thống phân loại tiêu chuẩn [17],[18],[19]. Năm 1971 Knudson đề xuất một giả thuyết “two hit” cho sự phát triển của bệnh u nguyên bào võng mạc. Theo thuyết này cần phải có 2 lần đột biến để phát triển thành bệnh. Trong thể bệnh do di truyền: đột biến đầu tiên là đột biến dòng tế bào gốc và được tìm thấy trong tất cả các tế bào của người bị ảnh hưởng.

Đột biến thứ hai xảy ra trong một tế bào võng mạc duy nhất trong quá trình biệt hóa, dẫn đến sự phát triển không thể kiểm soát của các tế bào võng mạc và gây nên bệnh UNBVM. Ở bệnh không do di truyền thì cả hai lần đột LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 biến xuất hiện trong tế bào võng mạc trong quá trình biệt hóa. Hai sự kiện đột biến độc lập sau sinh sẽ kéo dài hơn, giải thích tại sao các khối u võng mạc thể không di truyền (rải rác) xảy ra ở lứa tuổi lớn hơn bệnh nhân bị bệnh do di truyền. Fung và cộng sự (1987) trong 16 mẫu của 40 BN UNBVM nghiên cứu nhận thấy sự thay đổi trong cấu trúc gen RB1 đã được nhận diện, bao gồm: trong một số trường hợp, xóa đoạn đồng hợp tử tương ứng với giảm khả năng phiên mã.

Một trường hợp u xương ác tính cũng có xóa đoạn đồng hợp tử với sự giảm khả năng phiên mã. Các điểm nóng “hot spot” có thể bị xóa được xác định trong các locus trên gen RB1. Trong số những khối u không có thay đổi về cấu trúc, có hoặc không có sự phiên mã RB1 hoặc có biểu hiện bất thường của phiên mã RB1 [20]. Bookstein và cs (1988) đã xác định ít nhất có 20 exon của gen RB1 và tạm thời đánh số chúng.

Làm sáng tỏ mất đoạn exon 2-6 của DNA từ 1 alen RB1, cũng như làm sáng tỏ những đột biến xóa các exon khác, giải thích nguồn gốc của sự giảm phiên mã RB mRNA [21]. Dunn và cộng sự (1989) sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để khuếch đại và giải trình tự các alen đột biến. Đột biến đã được xác định ở 15 trong số 21 mẫu khối u UNBVM; trong đó có 8 khối u xác định chính xác đột biến trong trình tự các nucleotide. Có 4 đột biến ở dòng tế bào gốc bao gồm một đột biến xóa nhỏ hoặc đột biến lặp lại, trong khi 3 đột biến soma là đột biến điểm dẫn tới những biến đổi tại vị trí ghép nối và mất của một exon [22].

Bằng kỹ thuật PCR, Dryja và cộng sự (1989) đã chứng minh sự thay đổi nucleotide duy nhất trong khối u của 7 bệnh nhân bị UNBVM (không có tiền sử gia đình của bệnh). 4 bệnh nhân trong số này, đột biến chỉ thấy ở các tế bào khối u, và 3 trong đó liên quan đến tế bào soma bình thường cũng như các tế bào khối u nhưng không tìm thấy trong cha hoặc mẹ. Do đó, các đại diện 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 đột biến tế bào gốc mới (3 đột biến còn lại). Tất cả 3 đột biến đã chuyển C thành T trong chuỗi mã hóa trong gen UNBVM, 5 đột biến xảy ra trong exon 21-24 khu vực mà chỉ chiếm 15% của chuỗi mã hóa của gen RB1.

Người ta đã tìm thấy rằng các protein bất thường từ các axit amin được mã hoá bởi các exon đã bị mất đoạn [23]. Ở Việt Nam Đã có rất nhiều các nghiên cứu đã và được tiến hành trong thời gian gần đây về bệnh UNBVM cung cấp nhiều thông tin phục vụ cho chẩn đoán sớm ở mức độ sinh học phân tử. Tại Việt Nam, những năm gần đây đã có những nghiên cứu của một số tác giả về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, cũng như điều trị đối với bệnh UNBVM ở bệnh nhi tại Bệnh viện Mắt Trung Ương của nhóm tác giả Lê Thúy Quỳnh, Nguyễn Minh Châu, Trần Thu Hương năm 2010 – 2012. Phạm Bảo Nghĩa năm 2013.

Số liệu và các thông tin về gen liên quan tới bệnh UNBVM còn hạn chế. Hiện nay Trung tâm nghiên cứu Gen–Protein tại Trường Đại học Y Hà Nội đã và đang nghiên cứu về bệnh học phân tử liên quan tới UNBVM như: xác định đột biến gen, phát hiện người lành mang gen bệnh giúp cho công tác chẩn đoán, điều trị bệnh và tư vấn di truyền. Dịch tễ bệnh UNBVM UNBVM là một trong những bệnh có tỷ lệ sống sót cao nhất trong số tất cả các bệnh ung thư ở trẻ em. Tại Hoa Kỳ tỷ lệ sống sót của bệnh nhân UNBVM là hơn 93%, [5],[16],[12].

Năm 2009 MacCarthy báo cáo tỷ lệ sống sót sau 5 năm ở trẻ UNBVM thể một mắt ở Anh tăng từ 85% (giai đoạn 1963-1967) lên 97% (giai đoạn 1998-2002). Tỷ lệ tương đương đối với các trường hợp bệnh hai mắt là 88% và 100%. Các tác giả cho rằng chủ yếu là do việc đưa hóa trị liệu toàn thân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.