Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu đột biến gen trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm - Trường Đại học Y Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI - 2019 luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi là Nguyễn Thị Thơm, nghiên cứu sinh khoá 34 Trường Đại học Y Hà Nội, Chuyên ngành Hoá sinh Y học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Cô Đặng Thị Ngọc Dung. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ một nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam.

Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2019 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Thơm luan an DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair Cặp base nitơ CBTRUS Central Brain Tumor Registry of Trung tâm quản lý u não Hoa the United States Kỳ DNA Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleoside triphosphate Nucleotid tự do EGFR Epidermal Growth Factor Receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi IDH Isocitrate dehydrogenase Enzym Isocitrate dehydrogenase MGMT Methylguanine DNA Enzym Methylguanine DNA methyltransferase methyltransferase MLPA Multiplex Ligation - dependent Khuếch đại DNA đầu dò đa Probe Amplifcation mồi mRNA RNA messenger RNA thông tin PCR Polymerase Chain Reaction Chuỗi phản ứng enzym TACC Transforming, Acidic Coiled-Coil Gen mã hoá Protein Acidic Containing Protein Coiled-Coil Containing TP53 Tumor protein 53 Gen ức chế khối u TP53 RNA Ribonucleic Acid Axit Ribonucleic RTK Receptor tyrosin kinase Thụ thể nội bào UNBTK U nguyên bào thần kinh đệm Đ MỤC LỤC luan an ĐẶT VẤN ĐỀ.1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN. Đại cương về u nguyên bào thần kinh đệm.

Tình hình mắc u nguyên bào thần kinh đệm trong nước và trên thế giới. Phân loại u nguyên bào thần kinh đệm. Dự phòng. Nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm.

Nguyên nhân gây bệnh. Cơ chế sinh bệnh trong u nguyên bào thần kinh đệm. Đặc điểm người bệnh U nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen và thời gian sống sau điều trị. Đặc điểm nguyên phát và thứ phát.

Thời gian sống sau điều trị của người UNBTKĐ phát hiện thấy đột biến gen. Kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen trong u nguyên bào thần kinh đệm. Kỹ thuật PCR. Kỹ thuật khuếch đại DNA đầu dò - MLPA.

Kỹ thuật giải trình tự gen.50 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Tiêu chuẩn chọn mẫu. Tiêu chuẩn loại trừ.

Cách tiến hành chọn mẫu nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu. Cỡ mẫu nghiên cứu.

Dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu:. Các bước nghiên cứu. Thời gian, địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Xử lý số liệu. Đạo đức trong nghiên cứu. Biện pháp tránh sai số.

Kinh phí thực hiện đề tài.62 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu. Đặc điểm về tuổi. Đặc điểm về giới.

Kết quả xác định một số đột biến trên gen TP53, EGFR, FGFR ở người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô paraffin. Một số hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân bản các exon nghiên cứu của gen TP53, EGFR, FGFR. Kết quả giải trình tự gen xác định đột biến trên gen TP53.

Kết quả xác định đột biến trên gen EGFR. Kết quả giải trình tự phát hiện đột biến trên exon 12 và exon 13 gen FGFR. Tổng hợp các đột biến trên 3 gen nghiên cứu: gen TP53, EGFR, FGFR. Tổng hợp các đột biến kép trên 3 gen nghiên cứu: gen TP53, EGFR, FGFR.

Một số đặc điểm của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen. Đặc điểm về tuổi và giới của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen. Đặc điểm về kích thước khối u của người bệnh đột biến gen. Đặc điểm về thể bệnh nguyên phát và thứ phát.

Phân bố thời gian sống của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen có điều trị xạ trị, hóa chất.94 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu. Đặc điểm đột biến trên các gen nghiên cứu. Đặc điểm DNA tách chiết từ mẫu mô paraffin.

Đặc điểm về kết quả PCR nhân bản các exon xác định đột biến điểm của các gen nghiên cứu. Đặc điểm đột biến điểm trên exon 7, exon 8 gen TP53. Đặc điểm đột biến từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR. Đặc điểm đột biến điểm trên exon 12, exon 13 gen FGFR.

Một số đặc điểm của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen. Đặc điểm tuổi và giới của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen. Đặc điểm về kích thước khối u ở người thấy đột biến gen trong bệnh UNBTKĐ. Đặc điểm hai thể bệnh nguyên phát và thứ phát của UNBTKĐ.

Đặc điểm về thời gian sống của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen.135 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC luan an DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Đặc điểm 2 thể bệnh UNBTKĐ nguyên phát và thứ phát. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. Đặc điểm về tuổi của người bệnh trong nghiên cứu.

Kết quả phát hiện đột biến điểm trên exon 2,3,7 gen EGFR. Tỉ lệ các dạng đột biến trên gen EGFR. Kiểu xóa đoạn từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR. Tổng hợp số lượng đột biến từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR.

Kết quả phát hiện đột biến điểm trên gen FGFR. Các đột biến kép trên 3 gen TP53, EGFR, FGFR. Tuổi trung bình của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen. Tuổi trung bình của hai giới nam và nữ.

Đặc điểm về phân bố tuổi ở người bệnh đột biến gen EGFR. Đặc điểm về tuổi của người bệnh UNBTKĐ đột biến 1 trong 3 gen nghiên cứu. Đặc điểm về giới của người UNBTKĐ phát hiện thấy đột biến gen. Phân bố kích thước khối u của người bệnh đột biến gen FGFR.

Phân bố kích thước khối u của người đột biến gen EGFR. Phân bố kích thước khối u của người đột biến một trong 3 gen FGFR - EGFR - TP53. Tỷ lệ thể bệnh nguyên phát và thứ phát. Tuổi trung bình của hai thể nguyên phát và thứ phát.

Thời gian trung bình từ khi phát hiện bệnh đến khi phẫu thuật. Phân bố thời gian từ khi phát hiện bệnh đến khi phẫu thuật của thể nguyên phát và thể thứ phát. Phân bố thời gian sống sau phẫu thuật của thể nguyên phát và thể thứ phát.92 luan an Bảng 3. Phân bố thời gian từ khi phát hiện bệnh đến khi chết của thể nguyên phát và thể thứ phát.

Tuổi trung bình của người bệnh đột biến gen. Phân bố thời gian sống sau phẫu thuật của thể nguyên phát và thể thứ phát có điều trị xạ trị, hóa chất. Thời gian sống của người bệnh sau phẫu thuật có điều trị. Thời gian sống của người bệnh đột biến gen FGFR sau phẫu thuật có điều trị xạ trị, hóa chất.

Thời gian sống của người bệnh đột biến gen EGFR sau phẫu thuật có điều trị xạ trị, hóa chất. Thời gian sống của người bệnh sau phẫu thuật đột biến 1 trong 3 gen, có điều trị xạ trị, hóa chất. Thời gian sống của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen FGFR tính từ khi phát hiện mắc bệnh đến lúc chết có điều trị xạ trị, hóa chất. Thời gian sống của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen EGFR tính từ khi phát hiện mắc bệnh đến lúc chết có điều trị xạ trị, hóa chất.

Thời gian sống của người bệnh đột biến 1 trong 3 gen nghiên cứu tính từ khi phát hiện mắc bệnh đến lúc chết có điều trị.101 luan an DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các đặc điểm mô học của u tế bào hình hạt nhỏ. Ảnh chụp MRI và mô bệnh học của UNBTKĐ. Hình ảnh minh hoạ sự phân bố và tần suất đột biến gen TP53 trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.

Vị trí gen EGFR trên NST số 7. Các cơ chế kích hoạt và các đường dẫn tín hiệu do EGFR thực hiện. Vị trí đột biến gen EGFR trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm. Ảnh nhuộm miễn dịch học của EGFR trong mô UNBTKĐ.

Thời gian sống còn của người bệnh UNBTKĐ. Vị trí của gen FGFR1 trên NST (A) Vị trí của gen FGFR3 trên NST (B). Cấu trúc, vị trí hoạt động và con đường tín hiệu thông qua thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGFRs. Hình ảnh đột biến gen FGFRs trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.

Vị trí của TACC3 trên NST số 4. Kết quả thử nghiệm chất JNJ-42756493 trên chuột có UNBTKĐ. Sự thay đổi kích thước khối u và thời gian sống kéo dài của bệnh nhân có đột biến gen FGFR sau điều trị bằng chất ức chế JNJ-42756493. (A) So sánh tỷ lệ sống còn của người bệnh UNBTKĐ có đột biến gen dạng EGFRvIII và người không có đột biến.

Phản ứng PCR (thành phần và sản phẩm). Ảnh kết quả đột biến điểm gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm. Hình ảnh probe và quy trình phản ứng MLPA.48 luan an Hình 1. Hình ảnh điện di xác định đột biến gen dạng EGFRvIII bằng kỹ thuật MLPA.

Ảnh kết quả giải trình tự xác định đột biến gen FGFR. Hình ảnh kết quả chạy điện di mao quản mẫu DNA chuẩn của người nam. Đặc điểm về giới của người bệnh trong nghiên cứu. Hình ảnh minh họa kết quả đo OD của mẫu DNA tách chiết bằng máy Nanodrop 1000.

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân bản các exon nghiên cứu. Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 8 gen TP53 có chứa đột biến điểm p. Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 8 gen TP53 chứa đột biến điểm p. Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 2 gen EGFR chứa đột biến điểm p.

Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 2 gen EGFR chứa đột biến điểm p. Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 3 gen EGFR chứa đột biến điểm p. Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 3 gen EGFR chứa đột biến điểm p.