Luận án tiến sĩ: Giá trị phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai bằng DNA thai tự do

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ‘ HOÀNG HẢI YẾN NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI HOÀNG HẢI YẾN NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS. Tạ Thành Văn PGS. Nguyễn Duy Ánh HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy: GS. Tạ Thành Văn - Hiệu trưởng, Trưởng Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã luôn tận tình chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức và ý kiến quý báu, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án.

Nguyễn Duy Ánh - Giám đốc Bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Phó trưởng Bộ môn Phụ Sản Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã hết lòng hướng dẫn, chỉ dạy, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Thầy, Cô Chủ tịch Hội đồng, các Thầy, các Cô trong Hội đồng chấm luận án đã có nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thiện Luận án. Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi để tôi hoàn thành luận án. Đảng ủy, Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Trung tâm Đào tạo, Trung tâm Sàng lọc, Chẩn đoán trước sinh và sơ sinh Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Các Thầy, các Cô, các anh, các chị tại Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu. Các anh, các chị, các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm Sàng lọc, Chẩn đoán trước sinh và sơ sinh, Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội đã luôn hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Ban Giám đốc, các anh, các chị, các bạn Công ty CP Thiết bị SISC Việt Nam đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện và hỗ trợ một phần kinh phí trong quá trình thực hiện nghiên cứu.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới tất cả các thai phụ đã tham gia trong nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án và tiếp thêm động lực cho tôi để tiếp tục phấn đấu trong chuyên môn cũng như trong nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ tôi, người đã sinh thành, nuôi dưỡng, yêu thương và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập; chồng và hai con gái và những người thân trong gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ và ở bên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành được luận án. Hà Nội, ngày 10 tháng 4 năm 2020 Hoàng Hải Yến LỜI CAM ĐOAN Tôi là Hoàng Hải Yến, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy: GS.

Tạ Thành Văn và PGS. Nguyễn Duy Ánh. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2020 Người viết cam đoan Hoàng Hải Yến DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACMG The American College of Medical Genetics Hiệp hội gen và di truyền y học and Genomics của Hoa Kỳ ACOG American College of Obstetricians and Hội Thai phụ khoa Hoa Kỳ Gynecologists AF Amniotic fluid Dịch ối AMA Advanced Maternal Age Tuổi thai phụ cao (≥ 35 tuổi) AQ Aligment Quality Chất lượng khớp bp Base Pair Cặp base cffDNA Cell Free Fetal DNA DNA thai tự do CFTS Combined First Trimester Screening Sàng lọc kết hợp thai kỳ 1 CNV Copy Number Variation Biến thể số lượng bản sao CSS Chromosome Selective Sequencing Giải trình tự nhiễm sắc thể chọn lọc (mục tiêu) CPM Confined Placental Mosaicism Khảm giới hạn rau thai CV Coefficient of Variation Điểm biến thiên CVS Chorionic Villus Sampling Lấy mẫu gai rau DANSR Digital Analysis of Selected Regions Phân tích số các vùng chọn lọ DN Data Noise Dữ liệu nhiễu DNA Deoxyribo Nucleic Acid Acid nucleic DTBS Dị tật bẩm sinh GC Guanine Cytosine GRCh37 Genome Reference Consortium human HG Human Genome Hệ gen người ISP Ion Sphere Particle ISPD International Society for Prenatal Hiệp hội Chẩn đoán trước sinh Diagnosis quốc tế ISUOG The International Society of Ultrasound in Hội Siêu âm thai phụ khoa Thế Obstetrics & Gynecology giới MPSS Massively Parallel Shotgun Sequencing Giải trình tự đồng thời số lượng lớn ngẫu nhiên NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới NIPS Noninvasive Prenatal Screening Sàng lọc trước sinh không xâm lấn NSGC National Society of Genetic Counselors Hội quốc gia về tư vấn di truyền NST Chromosome Nhiễm sắc thể NT Nuchal Translucency Độ mờ da gáy PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PPR Posteriori Risk Nguy cơ sau xét nghiệm SCA Sex Chromosome Aneuploidy Lệch bội NST giới tính SMFM Society for Maternal-Fetal Medicine Hội Y học thai phụ và thai SNPs Single Nucleotide Polymorphisms Đa hình đơn nucleotide TFM True Fetal Mosaicism Khảm thai thực sự TMAP Torrent Mapping Alignment Program Thuật toán TMAP URs Unique Reads Trình tự duy nhất MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.1 Chương 1: TỔNG QUAN. Bất thường nhiễm sắc thể thai. Tần suất xuất hiện.

Hậu quả của bất thường nhiễm sắc thể. Các bất thường NST thai thường gặp trong sàng lọc và chẩn đoán trước sinh. Tổng quan về một số xét nghiệm sàng lọc, chẩn đoán trước sinh phát hiện bất thường NST. Các xét nghiệm sàng lọc trước sinh truyền thống.

Các phương pháp chẩn đoán trước sinh. Tổng quan về DNA thai tự do trong máu thai phụ. Lịch sử phát hiện DNA tự do trong máu thai phụ. Nguồn gốc DNA tự do trong huyết tương.

Nguồn gốc và đặc điểm DNA thai tự do trong huyết tương. Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ cffDNA. Các phương pháp tiếp cận tin sinh học xác định nồng độ cffDNA. Ứng dụng lâm sàng của cffDNA trong huyết tương thai phụ.

Giải trình tự gen thế hệ mới ứng dụng trong xét nghiệm NIPS. Nguyên lý giải trình tự thế hệ mới. Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới trong xét nghiệm NIPS. Nghiên cứu về DNA thai tự do tại Việt Nam.38 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Đối tượng nghiên cứu. Tiêu chuẩn lựa chọn. Tiêu chuẩn loại trừ. Phương pháp nghiên cứu.

Thiết kế nghiên cứu. Cỡ mẫu nghiên cứu. Phương tiện nghiên cứu. Các chỉ tiêu nghiên cứu.

Quy trình nghiên cứu. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu. Đạo đức trong nghiên cứu.55 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu. Phân bố tuổi thai phụ trong nghiên cứu. Phân bố theo nghề nghiệp và địa dư. Đặc điểm cân nặng nhóm thai phụ làm xét nghiệm NIPS.

Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng DNA tự do trong máu thai phụ. Chỉ định thai phụ làm xét nghiệm NIPS. Kết quả giải trình tự. Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y và đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới sử dụng DNA thai tự do trong huyết tương thai phụ.

Kết quả xét nghiệm NIPS. Phân tích giá trị của nồng độ cffDNA trong xét nghiệm NIPS.Kết quả xét nghiệm karyotype từ dịch ối trên mẫu có kết quả xét nghiệm NIPS dương tính. Các trường hợp kết quả xét nghiệm NIPS không phù hợp với kết quả xét nghiệm karyotype. Giá trị của xét nghiệm NIPS trong sàng lọc lệch bội NST thai.

Kết quả nghiên cứu. Đánh giá kết quả xét nghiệm NIPS dựa trên yếu tố nguy cơ.85 Chương 4: BÀN LUẬN. 131 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA NGHIÊN CỨU DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả xét nghiệm sàng lọc huyết thanh thai phụ phát hiện trisomy 21.

Kết quả phát hiện trisomy 21 theo tuổi thai phụ và nguy cơ*. Kết quả phát hiện trisomy 18, 13*. So sánh các phương pháp sàng lọc. Kết quả sàng lọc trisomy 21, 18, 13.

Đánh giá kết quả xét nghiệm NIPS. Đặc điểm tuổi thai phụ trong nghiên cứu. Đặc điểm cân nặng nhóm thai phụ làm xét nghiệm NIPS. Tuổi thai tại thời điểm làm xét nghiệm NIPS.

Yếu tố nguy cơ của thai phụ làm xét nghiệm NIPS. Nồng độ DNA tự do và nồng độ DNA thư viện. Kết quả chất lượng ISP trên chíp giải trình tự. Chất lượng khớp của đoạn đọc với trình tự hg19.

Tỷ lệ thành công của xét nghiệm NIPS. Tỷ lệ thất bại của của xét nghiệm NIPS. Kết quả giải trình tự. Kết quả điểm z-score NST 21, 18, 13, X.

Tỷ lệ lệch bội NST trong xét nghiệm NIPS. Phân loại lệch bội NST với xét nghiệm NIPS dương tính. Nồng độ cffDNA và tuổi thai. Nồng độ cffDNA và cân nặng thai phụ.

Kết quả xét nghiệm karyotype từ dịch ối. Các trường hợp kết quả xét nghiệm NIPS không phù hợp với kết quả xét nghiệm karyotype. Xét nghiệm NIPS dương tính với trisomy 21, 18, 13. Xét nghiệm NIPS dương tính với lệch bội NST giới tính.

Giá trị xét nghiệm NIPS. Giá trị tiên đoán dương dựa vào yếu tố nguy cơ. Kết quả xét nghiệm NIPS liên quan đến tuổi thai phụ. Kết quả xét nghiệm NIPS liên quan đến sàng lọc huyết thanh thai phụ nguy cơ cao trisomy 21.

Kết quả xét nghiệm NIPS liên quan đến siêu âm bất thường.