Luận án nghiên cứu vai trò điều hòa gen A20 (TNFAIP3) và cơ chế phân tử kiểm soát sinh lý tế bào tua

MỤC LỤC MỞ ĐẦU. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU. Khái niệm và lịch sử nghiên cứu về protein A20. Cấu trúc gen A20 và protein A20.

Vai trò của protein A20 điều hòa một số loại tế bào miễn dịch. Vai trò của protein A20 trong tế bào T. Vai trò của protein A20 trong tế bào B. Vai trò của protein A20 trong tế bào tua.

Vai trò của protein A20 đối với sự chết theo chương trình apoptosis. Cơ chế điều hoà hoạt động của protein A20. Một số dòng tín hiệu phân tử hoạt động điều hoà bởi A20. Protein A20 điều hoà tín hiệu NF-кB.

Protein A20 điều hoà tín hiệu STATs. Vai trò của protein A20 đối với một số bệnh tự miễn và ung thư. Tình hình nghiên cứu về protein A20 trên thế giới và ở Việt Nam. Tế bào tua.

Khái niệm và lịch sử phát hiện tế bào tua. Đặc điểm sinh học của tế bào tua. Chức năng tế bào tua. Phân loại tế bào tua.

Các quá trình sinh lý tế bào tua. Sự biệt hoá của tế bào tua. Sự trưởng thành của tế bào tua. Sự di cư của tế bào tua.

Sự thực bào của tế bào tua. Sự tiết cytokine của tế bào tua. Sự chết theo chương trình của tế bào tua. Một số thụ thể Toll - like receptors kích hoạt hoạt động tế bào tua.

29 Kháng nguyên Lipopolysaccharide. 30 Kháng nguyên Profilin từ Toxoplasma gondii. Một số nghiên cứu ứng dụng về tế bào tua trong điều trị ung thư. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu nguyên liệu. Đối tượng nghiên cứu. Thiết bị nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp nuôi cấy và biệt hoá tế bào tua. Phương pháp đưa phân tử siRNA vào trong các tế bào tua. Kỹ thuật Western blot đo mức độ biểu hiện protein. Kỹ thuật ELISA đo nồng độ các cytokine tiết ra bởi tế bào tua.

Phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry analysis). Phương pháp xác định sự di cư tế bào (transwell migration assay). Phương pháp phân tích số liệu. 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN.

Vai trò của protein A20 điều hoà các chức năng sinh lý tế bào tua. Kết quả bất hoạt gen A20 trong tế bào tua. Vai trò của protein A20 điều hòa sự trưởng thành tế bào tua. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua.

Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng FLT3. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng GM-CSF. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng FLT3.

Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi phơi niễm với GM-CSF và phơi nhiễm LPS. Vai trò của protein A20 đối quá trình apoptosis của tế bào tua. Nghiên cứu một số tín hiệu phân tử liên quan đến quá trình sinh lý tế bào tua dưới vai trò điều hòa của protein A20. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong tế bào tua nhóm CD11b+DC khi phơi nhiễm với profilin.

Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong tế bào tua pDC khi phơi nhiễm với profilin. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa STAT1 và STAT3 trong tế bào tua nhóm CD11b+DC khi xử lý với LPS. Vai trò của protein A20 đối với một số chức năng sinh lý của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1. Vai trò của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1.

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm profilin. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 .Vai trò của protein A20 đối với sự di chuyển của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1. Vai trò của protein A20 đối với chức năng của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1. Vai trò của protein A20 đối với quá trình sản xuất cytokine của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1.

Vai trò của protein A20 trong điều hoà sự di chuyển của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1. 94 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .110 TÀI LIỆU THAM KHẢO.125 Phụ lục 1: Kết quả nuôi cấy tế bào tua. Khả năng sống sót và biệt hóa của tế bào tua sau nuôi cấy. Hình ảnh tế bào tua sau nuôi cấy.

Tế bào tua trưởng thành sau phơi nhiễm bởi Lipopolysaccharide. 127 Phụ lục 2: Sự tiết TNF-α của tế bào tua. 129 Phụ lục 3: Ảnh hưởng của một số cytokine đối với quá trình apoptosis của tế bào CD11b+DC. Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V dưới tác động của cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và INF-γ.

Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 dưới tác động của cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ. 132 Phụ lục 4: Vai trò điều hòa của IL-10 đối với sự phosphoryl hóa STAT1 và STAT3 trong tế bào tua. Vai trò điều hoà của IL-10 đối với sự phosphoryl hoá STAT1. Vai trò điều hoà của IL-10 đối với sự phosphoryl hoá STAT3.

134 1 MỞ ĐẦU Protein A20 là protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3 (tumor necrosis factor α-induced protein 3 - TNFAIP3) có đặc tính chống viêm và điều hòa ngược hoạt động sinh lý của tế bào miễn dịch, thông qua việc ngăn chặn sự phosphoryl hóa một số tín hiệu phân tử như: nhân tố phiên mã NF-κB và tín hiệu STAT (signal transducer and activator of transcription). Các nghiên cứu di truyền cho thấy đột biến gen A20 làm thay đổi chức năng sinh học của protein A20 và là một trong những nguyên nhân gây ra các loại bệnh lý như bệnh tự miễn, viêm nhiễm và ung thư. Chuột bị bất hoạt gen A20 thường biểu hiện tình trạng suy nhược, mắc các bệnh tự miễn, viêm toàn bộ các cơ quan, bộ phận cơ thể và không sống sót được quá 2 tuần tuổi. Ở người, bất hoạt gen A20 đã được ghi nhận liên quan đến bệnh tự miễn và ung thư như các loại bệnh ung thư máu.

Tuy nhiên ảnh hưởng của protein A20 đến cơ chế bệnh sinh của các bệnh này vẫn chưa được tìm hiểu đầy đủ. Tế bào tua (TBT) là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp cho các tế bào lympho, có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Chỉ có các TBT mới có khả năng kích thích hình thành phản ứng miễn dịch ở tế bào lympho T trong trạng thái không hoạt động. TBT cũng đóng góp vào các chức năng của các tế bào lympho B và giúp duy trì trí nhớ miễn dịch của các tế bào này.

TBT sản xuất các cytokine và các yếu tố khác thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B. Các tế bào tua có mặt trong hầu hết các cơ quan lympho như lách và hạch bạch huyết, biểu mô da, các ống tiêu hóa và ống hô hấp, chính vì thế chúng dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh. TBT được chia làm hai nhóm bao gồm: TBT dòng lympho có nguồn gốc từ cơ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC) và TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC). Tế bào dòng tủy cDC được phân chia thành hai tập hợp con là CD8+DC và CD11b+DC có mức độ biểu hiện các loại thụ thể toll- like (toll-like receptor - TLR) khác nhau, do đó đóng vai trò khác nhau trong khả năng tương tác với mầm bệnh.

Một số nghiên cứu trước đây trên tế bào tua đã chỉ ra rằng protein A20 có khả năng ức chế khả năng sản xuất một số các cytokine. Tuy nhiên đến nay, chưa có công bố khoa học nào về vai trò, cơ chế phân tử của gen A20 trong điều hòa các 2 chức năng sinh lý TBT khi phơi nhiễm với kháng nguyên có nguồn gốc ký sinh trùng và ảnh hưởng của protein A20 đến hoạt động apoptosis của TBT khi bị kích thích bởi một số cytokine. Do đó, các thí nghiệm được tiến hành để nghiên cứu vai trò điều hoà của protein A20 đối với TBT khi được kích hoạt bởi một số kháng nguyên như profilin từ Toxoplasma gondii hay lipopolysaccharide (LPS) và một số cytokine, với tên đề tài: “Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua”. Luận án được thực hiện với các mục tiêu như sau: 1.

Đánh giá vai trò của gen A20 đối với việc điều hoà bốn chức năng sinh lý gồm sự trưởng thành, tiết cytokine, di cư và quá trình apoptosis của tế bào tua. Đánh giá ảnh hưởng của gen A20 đối với việc điều hòa ba tín hiệu phân tử NF-κB, STAT1 và STAT3 liên quan đến quá trình sinh lý tế bào tua. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Khái niệm và lịch sử nghiên cứu về protein A20 Protein A20 (hay còn được gọi là TNFAIP3 - tumor necrosis factor alpha- induced protein 3 - protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3) là protein ức chế phản ứng viêm chống lại các tác nhân gây viêm.

Protein A20 có chiều dài 790 axit amin và khối lượng phân tử 89,6 kDa. Protein này đóng vai trò là chất điều hoà của phản ứng miễn dịch trung gian thông qua kích hoạt yếu tố phiên mã kappa B (nuclear factor kappa B - NF-κB) [1]. Các nghiên cứu ban đầu cho thấy, A20 là một protein bảo vệ các tế bào khỏi quá trình apoptosis do TNF gây ra. Đến nay, A20 đã được công nhận rộng rãi là một protein kháng viêm, nó không chỉ chất ức chế con đường tín hiệu NF-κB phụ thuộc TNF, mà còn ức chế kích hoạt NF-κB để đáp ứng với Interleukin 1 (IL-1), CD40 và tín hiệu thông qua các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors - PRRs) và kích hoạt thụ thể kháng nguyên tế bào T và tế bào B [2].

Nghiên cứu in vivo đầu tiên về vai trò của protein A20 trong sinh lý mô là nghiên cứu trên mô hình chuột thiếu hụt A20 [3].