Luận án: Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc niêm mạc miệng

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu. Vùng rìa củng-giác mạc.

Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC. Phim nước mắt. Sự toàn vẹn của hai cung phản xạ điều tiết nước mắt. Chức năng của tế bào biểu mô BMNC được hỗ trợ bởi nguyên bào sợi nhu mô và chất cơ bản.

Cấu trúc biểu mô bề mặt khoang miệng. Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc. Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm vùng rìa. Phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc.

Những nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô NMM. Các loại nền nuôi cấy tế bào. Chuẩn bị mẫu mô NMM và xử lý miếng mô cho nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy.

Định danh tế bào của tấm biểu mô NMM nuôi cấy. Ứng dụng lâm sàng của tấm biểu mô NMM. Ứng dụng trong nhãn khoa. Ứng dụng lâm sàng trong các lĩnh vực khác.

36 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.Đối tƣợng nghiên cứu.Đối tượng và vật liệu nghiên cứu:. Mô hình nghiên cứu. Quy trình nuôi cấy. Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết cho nuôi cấy.

Thực nghiệm trên thỏ. Chuẩn bị màng ối. Chuẩn bị lớp 3T3 làm nền nuôi cấy. Chuẩn bị mảnh mô NMM cho nuôi cấy.

Môi trường nuôi cấy, quy trình nuôi cấy và theo dõi. Thu hoạch và định danh tế bào nuôi cấy. Thử nghiệm trên BN tự nguyện. Chỉ tiêu nghiên cứu.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu. Xử lí số liệu nghiên cứu. Đạo đức nghiên cứu.

54 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Kết quả nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệm. Lựa chọn vị trí sinh thiết và kích thước mảnh mô nuôi cấy. Lựa chọn môi trường nuôi cấy.

Lựa chọn phương pháp nuôi cấy. Hình thái và tốc độ phát triển của tấm biểu mô được nuôi cấy bằng các phương pháp khác nhau. Hình thái và tốc độ phát triển của lớp nguyên bào sợi. Kết quả định danh tế bào tấm biểu mô nuôi cấy bằng hóa mô miễn dịch.

Kết quả ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy cho thỏ gây bỏng thực nghiệm 78 3. Kết quả nuôi cấy tấm biểu mô NMM từ tế bào gốc NMM trên ngƣời. Lựa chọn vị trí sinh thiết và kích thước mảnh mô nuôi cấy. Lựa chọn môi trường nuôi cấy.

Lựa chon phương pháp nuôi cấy. Hình thái và tốc độ phát triển của tấm biểu mô. Kết quả định danh tế bào tấm biểu mô nuôi cấy bằng hóa mô miễn dịch 90 3. Kết quả ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy.

92 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN. Về lựa chọn nền nuôi cấy. Về vị trí và kích thƣớc của mảnh NMM dùng cho nuôi cấy. Về môi trƣờng nuôi cấy.

Về phƣơng pháp nuôi cấy. Phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô. Phương pháp nuôi bằng dịch treo. Phương pháp nuôi bằng mảnh biểu mô.

Về chất lƣợng tấm biểu mô nuôi cấy. Vấn đề tồn tại cần nghiên cứu tiếp để hoàn thiện quy trình nuôi cấy tấm biểu mô NMM. 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1. Hình ảnh sinh thiết giác mạc thỏ sau ghép ở các thời điểm 2.

Hình ảnh mắt của BN sau phẫu thuật ghép tấm biểu mô NMM tự thân 3. Quy trình nuôi cấy tấm biểu mô NMM DANH MỤC HÌNH Hình 1. Giác mạc thỏ bình thường. Cấu trúc biểu mô NMM.

Sơ đồ biệt hoá tế bào. Mô hình nghiên cứu. Mô hình nuôi cấy bằng mảnh mô. Mô hình nuôi cấy bằng dịch treo.

Niêm mạc thỏ vùng giữa má. Niêm mạc thỏ vùng giữa má. Niêm mạc môi thỏ. Tấm biểu mô sau nuôi cấy ba ngày.

Tấm biểu mô sau nuôi cấy 12 ngày. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 12 ngày. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 3 ngày. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 7 ngày.

Lát cắt đứng dọc của tấm biểu mô sau 21 ngày nuôi cấy. Tấm biểu mô sau nuôi cấy dịch treo 14 ngày. Ranh giới giữa hai tế bào tấm biểu mô nuôi cấy. Tấm biểu mô nuôi cấy 4 ngày.

Tấm biểu mô sau nuôi cấy 7 ngày. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 12 ngày. Lát cắt đứng dọc của tấm biểu mô sau 21 ngày nuôi cấy. Sau nuôi cấy bằng mảnh biểu mô 14 ngày.

Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy sau 14 ngày. Ranh giới các tế bào biểu mô tấm biểu mô nuôi cấy sau 14 ngày. Tế bào lớp đáy tấm biểu mô nuôi cấy thỏ sau nuôi cấy 14 ngày. Mặt đáy tế bào biểu mô sát với màng ối sau nuôi cấy 14 ngày.

Lớp 3T3 chuẩn bị cho nuôi cấy. Sự phát triển của nguyên bào sợi đáy giếng nuôi cấy ngày 3. Sự phát triển của nguyên bào sợi đáy giếng nuôi cấy ngày 5. Sự phát triển của nguyên bào sợi đáy giếng nuôi cấy ngày 10.

Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày. Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày. Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày. Niêm mạc vùng giữa má BN Phạm Ngọc T.

Niêm mạc vùng giữa má BN Phạm Ngọc T. Niêm mạc vùng giữa má BN Võ Nữ Ngọc Y. Niêm mạc vùng giữa má BN Võ Nữ Ngọc Y. Tấm biểu mô NMM của BN Nguyễn Hữu C.

Tấm biểu mô NMM của BN Phạm Ngọc T. Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy BN Nguyễn Văn L. Cấu trúc tế bào bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy BN Nguyễn Văn L. Ranh giới giữa các tế bào biểu mô nuôi cấy BN Nguyễn Văn L.

Tế bào lớp đáy của tấm biểu mô NMM nuôi cấy BN Lê Văn L. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy của BN Hoàng Tiến D. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy của BN Nguyễn Văn N. Mảnh mô gọt sau ghép 12 tháng của BN Võ Vũ Ngọc Y.

Lớp biểu mô sau khi bóc tách. Lớp biểu mô sau khi nạo lấy lớp đáy. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy ngày 16. Tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy.

Tấm biểu mô NMM nuôi cấy 18 ngày của BN Nguyễn Hữu L. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy 21 ngày của BN Lê Văn N. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy 21 ngày của BN Lê Văn N. 119 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.

Kết quả nghiên cứu lâm sàng của cấy ghép tấm biểu mô NMM. Tỷ lệ mọc của tấm biểu mô NMM bằng các môi trường nuôi cấy khác nhau. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô NMM bằng các phương pháp nuôi cấy khác nhau. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô NMM sử dụng lớp tế bào nuôi 3T3.

Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô NMM sử dụng lớp tế bào nuôi khác nhau. 60 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bề mặt nhãn cầu (BMNC) bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau như: bỏng mắt do hoá chất hoặc nhiệt, hội chứng Stevens-Johnson, nhiễm khuẩn mắt nặng, nhiều phẫu thuật thực hiện trên cùng một mắt, đeo kính tiếp xúc. Một trong những di chứng thường gặp khi tổn thương BMNC là hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc (Limbal stem cell deficiency-LSCD). Hậu quả của hội chứng này là làm mất độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt giác mạc.

Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc cũng có thể gây ra hiện tượng loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát, thậm chí có thể gây thủng giác mạc. Vì vậy, thị lực mắt bị bệnh bị suy giảm ở nhiều mức độ khác nhau [1],[2]. Để điều trị ngoại khoa hội chứng LSCD, các nhà nhãn khoa đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: ghép màng ối đơn thuần, ghép kết mạc rìa tự thân hoặc dị thân, ghép giác-củng mạc vùng rìa. Với phương pháp ghép kết mạc rìa, ghép giác-củng mạc rìa tự thân, mảnh mô dùng để ghép được lấy từ mắt lành phải khá lớn.

Phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy được cho là có nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng trước đây. Quá trình nuôi cấy đã giảm thiểu số lượng tế bào không có chức năng bình thường, việc sinh thiết vùng rìa có thể nhắc lại nếu cần thiết, giảm nguy cơ thải loại mảnh ghép vì trong tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy không có mặt của tế bào Langerhans-tế bào đóng vai trò trình diện kháng nguyên. Phương pháp này đã được thực hiện tương đối phổ biến trên thế giới [3],[4],[5],[6]. Tuy nhiên, phương pháp này lại không thực hiện được ở các trường hợp bệnh nhân (BN) tổn thương cả hai mắt.

2 Đối với các trường hợp BN bị tổn thương BMNC cả hai mắt, trước đây, các bác sỹ nhãn khoa đã sử dụng phẫu thuật ghép tế bào gốc dị thân từ mắt người thân trong gia đình hoặc từ vùng rìa giác mạc của người hiến. Tuy nhiên, những BN này phải dùng thuốc chống thải loại mảnh ghép và nguy cơ thải mảnh ghép khá cao [7],[8]. Trong cơ thể, biểu mô giác mạc và biểu mô lợp niêm mạc miệng (NMM) là loại biểu mô lát tầng không sừng hoá. Những tế bào lớp đáy của cả hai loại biểu mô này có khả năng phân chia để duy trì quá trình tái tạo sinh lý.

Cả hai loại biểu mô này đều có nguồn gốc phôi thai là ngoại bì da. và cộng sự (CS.) đã nuôi cấy thành công tấm biểu mô NMM và ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc [2],[9]. Cũng tác giả này là người đầu tiên mô tả thành công việc ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy trên người bị LSCD [10]. Sau đó rất nhiều tác giả thông báo thực hiện thành công kỹ thuật này [11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25].

Các nghiên cứu cho thấy hình dạng, kích thước và cấu trúc siêu vi của tế bào tấm biểu mô NMM nuôi cấy khá tương đồng với biểu mô giác mạc bình thường [26]. Như vậy, việc sử dụng tấm biểu mô NMM nuôi cấy để điều trị tổn thương giác mạc là một lựa chọn tốt cho các BN bị tổn thương cả hai mắt và không còn vùng rìa. Với mong muốn áp dụng vào Việt Nam một phương pháp điều trị mới cho các BN bị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cả hai mắt, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng” nhằm mục tiêu sau đây: 1.