Luận án tiến sĩ: Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi thai thành tế bào tiết dopamin - Nguyễn Phúc Hoàn, Đại học Y Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ------ NGUYỄN PHÚC HOÀN PHÂN LẬP, TĂNG SINH VÀ BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC NGOẠI BÌ THẦN KINH PHÔI – THAI THÀNH TẾ BÀO DẠNG TIẾT DOPAMIN LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2021 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ------ NGUYỄN PHÚC HOÀN PHÂN LẬP, TĂNG SINH VÀ BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC NGOẠI BÌ THẦN KINH PHÔI – THAI THÀNH TẾ BÀO DẠNG TIẾT DOPAMIN Chuyên ngành : Mô phôi thai học Ngành : Khoa học y sinh Mã số : 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. NGUYỄN MẠNH HÀ 2. NGUYỄN THỊ BÌNH HÀ NỘI – 2021 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Với sự nỗ lực của bản thân cùng với sự giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân, tôi đã hoàn thành luận án này. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến: - PGS.

Nguyễn Thị Bình, nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Nguyễn Mạnh Hà, Chủ nhiệm Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thiện luận án. Trịnh Bình, nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy là tấm gương sáng để tôi noi theo. - Các nhà khoa học đã đóng góp những ý kiến quý báu và giúp đỡ tôi khi thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận án.

- Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Y Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thiện luận án. - Toàn thể lãnh đạo, các Thầy, các Cô và các anh chị em Bộ môn Mô – Phôi và đặc biệt là nhóm nghiên cứu Đề tài cấp Nhà nước ĐTĐL/2013, Trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong công việc cũng như động viên tôi những lúc khó khăn. - Bạn bè, đồng nghiệp và những người thân yêu trong gia đình đã luôn ở bên tôi, khích lệ tôi và là chỗ dựa vững chắc cho tôi bất kể lúc nào tôi cần. Đặc biệt, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn tới các bệnh nhân đã đồng ý tham gia trong nghiên cứu để tôi có được bản luận án ngày hôm nay.

Tác giả luận án Nguyễn Phúc Hoàn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi là Nguyễn Phúc Hoàn, nghiên cứu sinh khóa 33, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Mô phôi thai học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Mạnh Hà và Cô Nguyễn Thị Bình. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan và là một phần kết quả của đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng quy trình phân lập, nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột và người để điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm” do PGS.

Nguyễn Mạnh Hà làm chủ nhiệm. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2021. Tác giả luận án Nguyễn Phúc Hoàn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt 6-OHDA 6-hydroxydopamine BrdU BromodeoxyUridine ChAT Choline acetyltransferase DAT Dopamin transporter Dulbecco’s modified Eagle’s DMEM Medium EDTA EthyleneDiamineTetraAcetic EGF Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu mô EGFR Epidermal growth factor receptor Receptor của EGF Fluorescence-activated cell Dòng chảy tế bào huỳnh quang FACS sorting kích hoạt FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò Yếu tố tăng trưởng nguyên bào FGF Fibroblast growth factor sợi FGFR Fibroblast growth factor receptor Receptor của FGF GABA Gamma-aminobutyric acid GFAP Glial fibrillary acidic protein GFP Green Fluoro Protein Protein phát sáng xanh H-E Hematoxyline – Eosine HMMD Hóa mô miễn dịch iDA Induced dopaminergic neuron Nơron tiết dopamin cảm ứng iN Induced neuronal Nơron cảm ứng iPSC(s) Induced pluripotent stem cell(s) Tế bào gốc vạn năng cảm ứng MACS Magnetic-activated cell sorting Dòng chảy tế bào từ tính LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MAP-2 Microtubule-associated protein2 mDA Midbrain dopaminergic Nơron tiết dopamin ở não giữa Mesencephalic Neuroepithelial M-NECs Tế bào gốc ngoại bì thần kinh Stem cells 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- MPTP tetrahydropyridine NeuN Neuronal Nuclei NF Neurofilament OEC Olfactory Ensheating Cell Tế bào khứu giác PBS Phosphate buffered saline PET Position Emission Tomography Chụp cắt lớp phát xạ SGZ Subgranular zone SVZ Subventricular zone TH Tyroxin hydroxylase Unified Parkinson’s disease Thang điểm xếp loại bệnh UDPRS Rating Scale Parkinson HydroxyEthyl Piperazine Hệ đệm sử dụng trong môi HEPES EthaneSulfonic acid trường nuôi cấy tế bào HBSS Hanks’Balanced Salt Solution DMSO Dimethyl Sulfoxide Polysialylated-neural cell PSA-NCAM adhesion molecule LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN. Đặc điểm tế bào gốc thần kinh. Quá trình hình thành và biệt hóa nơron tiết dopamin in vivo. Tế bào gốc não giữa và nơron tiết dopamin: ứng dụng trong điều trị.

Phân lập, nuôi cấy và bảo quản lạnh tế bào gốc sàn não giữa phôi. Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh. Định danh tế bào gốc thần kinh và tế bào tiết dopamin. Định danh tế bào gốc thần kinh.

Định danh tế bào tiết dopamin. Bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh và nơron tiết dopamin. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Các bước tiến hành. Các bước tiến hành trên phôi chuột.

Các bước tiến hành trên phôi người. Chỉ tiêu nghiên cứu. Trang thiết bị, vật tư hóa chất dùng trong nghiên cứu. Trang thiết bị.

Vật tư tiêu hao. Hóa chất, môi trường. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu. Kỹ thuật hiển vi.

46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kỹ thuật siêu vi. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch. Kỹ thuật đếm tế bào TH.

Xử lí số liệu nghiên cứu. Đạo đức nghiên cứu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Phân lập, tăng sinh và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột.

Phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh sàn não giữa phôi chuột theo nhóm tuổi. Nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột E12,5 – E13,5. Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người 74 3.

Phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc biểu mô ống thần kinh phôi người tạo nơron tiết dopamin. 77 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột.

Xác định vị trí phẫu tích tế bào gốc ngoại bì thần kinh. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phân lập từ sàn não giữa trên phôi chuột từ 10,5 đến 14,5 ngày. Nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột cống trắng giai đoạn E12,5 – E13,5. Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi.

Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người. Thuận lợi và khó khăn trong quá trình thu thập phôi và phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người. 101 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc của biểu mô ống thần kinh phôi người 6,5 - 7,5 tuần tuổi 102 4.

Sự phát triển của các tế bào nuôi cấy và định danh các tế bào sau nuôi cấy. Hiệu quả nuôi cấy tạo nơron tiết dopamin. 113 KHUYẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP. 115 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1.

Những marker bề mặt tế bào thần kinh nhạy cảm với enzyme. Phân bố phôi chuột theo độ tuổi. Tỷ lệ trích thủ thành công mẫu mô não giữa qua các giai đoạn. Tỷ lệ mọc mẫu theo tuổi phôi.

Tỷ lệ tế bào, cụm tế bào dương tính với marker TH sau nuôi cấy. Tỷ lệ sống của các tế bào thần kinh sau rã đông. Đánh giá tỷ lệ sống của tế bào theo thời gian. Sự phân bố tuổi phôi, khả năng phẫu tích, phân lập của các phôi.

Tổng số tế bào sau phân lập và tỷ lệ tế bào sống. Sự phân bố số tế bào dương tính với TH trong giếng nuôi cấy theo tuổi phôi. 81 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. Tổng số tế bào sau phân lập.

Tỷ lệ mọc mẫu nuôi cấy sau rã đông. Sự gia tăng số lượng tế bào dương tính với TH theo ngày nuôi cấy. 82 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các nguồn tế bào khác nhau trong điều trị bệnh Parkinson.

Sự tăng sinh tế bào ở ống thần kinh. Các lớp của lá đáy não giữa và sự biểu hiện các gen liên quan đến sự phát triển của tế bào mDA. Hình ảnh chụp PET với 6-L- fluorodopa ở vùng nhân bèo nhạt và bèo sẫm.1: Sơ đồ nghiên cứu nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng tạo nơron tiết dopamin. Phẫu tích não giữa theo Jan Pruszak và cộng sự.

Cấu tạo vi thể não giữa phôi chuột cống trắng. Sàn mô não giữa. Sàn não giữa phôi chuột cống trắng E13. Cấu trúc siêu vi của biểu mô thần kinh não giữa E11.

Tế bào lớp nội tủy đang phân chia. Cấu trúc siêu vi của nguyên bào thần kinh E11. Các tế bào đang trong quá trình biệt hóa của phôi E13. Các nhánh bào tương của các nơron não giữa phôi E12.

Các nhánh bào tương tập trung thành nhóm ở phôi E12. Nón tăng trưởng ở phôi E12. Các tế bào tiền thân tiết dopamine tại thành não giữa phôi chuột cống trắng E11. Số lượng các tế bào tiền thân tiết dopamine tăng ở phôi E13.

Các tế bào tiết dopamine tập trung ở vùng sàn não giữa ở phôi chuột cống trắng E13. Tế bào gốc não giữa nuôi cấy. 67 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.