Xác định các gen alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống lú

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG THỊ PHƢƠNG NHUNG XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng Mã số: 9 62 01 11 Người hướng dẫn khoa học: GS. Đỗ Năng Vịnh GS. Pascal Gantet NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc sử dụng để bảo vệ bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Phùng Thị Phƣơng Nhung i LỜI CẢM ƠN Tác giả luận án xin trân trọng cảm ơn: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Nông học, Bộ môn Di truyền và Chọn giống cây trồng; Viện Di truyền Nông nghiệp, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Phòng Thí nghiệm Liên kết Việt - Pháp (LMI - Rice); Trung tâm Tài nguyên Thực vật; Trung tâm Hợp tác Quốc tế Nghiên cứu Nông nghiệp vì sự Phát triển (CIRAD - Pháp), đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin cảm ơn: Học bổng GRiSS - Chƣơng trình Đối tác Nghiên cứu Lúa gạo Toàn cầu (GRiSP), Trung tâm Hợp tác Quốc tế Nghiên cứu Nông nghiệp vì sự Phát triển (CIRAD - Pháp),Viện Nghiên cứu Phát triển (IRD - Pháp), “Chƣơng trình Trọng điểm Phát triển và Ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và PTNT đến năm 2020” - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam, đã tài trợ kinh phí cho các phần nghiên cứu của tôi. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: GS. Đỗ Năng Vịnh, GS.

Pascal Gantet những ngƣời thầy đã chỉ bảo, định hƣớng khoa học cho nghiên cứu của tôi, hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của tôi đến TS. Brigitte Courtois, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, tập huấn cho tôi các kỹ năng về phân tích hệ gen, phân tích đa dạng di truyền, sử dụng các phần mềm tin sinh học và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập của tôi tại CIRAD - Pháp. Tôi xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô, đồng nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ, động viên và đóng góp nhiều ý kiến cho việc hoàn thành luận án này; Các cộng tác viên, kỹ thuật viên, tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Phòng Thí nghiệm Liên kết Việt - Pháp, Viện Di truyền Nông nghiệp; Bộ môn Quản lý Ngân hàng gen - Trung tâm Tài nguyên Thực vật; Phòng Nghiên cứu Di truyền - CIRAD - Pháp, đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm và hoàn thành luận án này.

Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn các thành viên trong gia đình, ngƣời thân, bạn bè đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Phùng Thị Phƣơng Nhung ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.

v Danh mục bảng. vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận án. ix Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của đề tài.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu. Vai trò và đặc điểm bộ rễ ở lúa. Vai trò của bộ rễ ở cây lúa.

Đặc điểm cấu trúc của bộ rễ lúa. Đặc điểm phát triển của bộ rễ lúa. QTLs và gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ lúa. Các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ lúa.

Các gen liên quan đến sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa. Nguyên lý và ứng dụng của GBS. Phƣơng pháp giải trình tự NGS – nền tảng của GBS. Nguyên lý của phƣơng pháp GBS.

Các ứng dụng của GBS trong chọn giống cây trồng. Nguyên lý và ứng dụng của GWAS. GWAS là một công cụ mới hữu hiệu. Các bƣớc xây dựng một nghiên cứu GWAS.

Ý nghĩa và tiềm năng của GWAS trong chọn tạo giống lúa. Nguồn gen lúa và tình hình nghiên cứu bộ rễ lúa ở Việt Nam. Nguồn gen lúa Việt Nam. Tình hình nghiên cứu đặc điểm bộ rễ lúa ở Việt Nam.

Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Phƣơng pháp nghiên cứu. Đánh giá đặc điểm nông sinh học. Chiết tách ADN tổng số.

Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT. Phân tích kiểu gen thông qua giải trình tự (GBS). Phân tích cấu trúc di truyền của tập đoàn mẫu giống nghiên cứu. Xác định mức độ phân rã của Linkage Disequilibrium.

Phƣơng pháp đánh giá kiểu hình bộ rễ. Lập bản đồ liên kết (GWAS). Phƣơng pháp xác định các gen ứng viên. Kết quả và thảo luận.

Đặc điểm của bộ sƣu tập giống lúa. Đặc điểm thu đƣợc qua thông tin hồ sơ mẫu giống. Đặc điểm nông sinh học cơ bản. Kết quả phân tích đa dạng di truyền với chỉ thị DART.

Kết quả phân tích đa hình và cấu trúc di truyền. Xây dựng cây phân loại cho các mẫu giống lúa nghiên cứu. Kết quả phân tích kiểu gen thông qua giải trình tự (GBS – Genotyping By Sequencing). Kết quả phân tích đa hình và cấu trúc di truyền với SNPs marker.

Đặc điểm của các mẫu giống lúa trong các phân nhóm khác nhau. Kết quả phân tích Linkage Disequilibrium (LD). Kết quả đánh giá kiểu hình các tính trạng liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở các mẫu giống nghiên cứu. Kết quả phân tích phƣơng sai và các thống kê cơ bản.

Kết quả phân tích thành phần chính cho các tính trạng nghiên cứu. Kết quả phân tích liên kết toàn hệ gen (GWAS). Các QTLs liên kết với tính trạng liên quan đến sự phát triển bộ rễ. Các gen ứng viên liên quan đến đặc điểm phát triển bộ rễ.

Điểm đặc biệt của vùng QTLs liên kết với NCR trên NST số 11. Kết luận và kiến nghị. 130 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án. 131 Tài liệu tham khảo.

132 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Đa hình độ dài các đoạn nhân Polymorphism bản chọn lọc ANOVA Analysis of Variance Phân tích phƣơng sai bp Base pair Đơn vị đo độ dài ADN/ARN theo số cặp nucleotide (1bp = 1 cặp nucleotide) Chr Chromosome Nhiễm sắc thể cM Centimorgan Đơn vị đo khoảng cách giữa 2 locus trên NST, 1cM = 1% tần số trao đổi chéo giữa 2 locus DAPC Discriminant Analysis of Principal Phân tích phân biệt thành phần Components chính DArT Diversity Array Technology Công nghệ phân tích đa dạng mảng GBS Genotyping By Sequencing Phân tích kiểu gen thông qua giải trình tự GLM General Linear Model Mô hình hồi quy tuyến tính tổng quát GWAS Genome-wide Association Studies Nghiên cứu lập bản đồ liên kết toàn hệ gen kb Kilo base pair 1kb =1000 bp LD Linkage Disequilibrium Sự mất cân bằng liên kết MAF Minor Allele Frequency Alen có tần số nhỏ hơn Mb Megabase pair 1Mb = 1000 kb MLM Mix Linear Model Mô hình hồi quy tuyến tính hỗn hợp NGS Next Generation Sequencing Công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo NILs Near Isogenic Lines Dòng đẳng gen PCA Principal Component Analysis Phân tích thành phần chính PCR Polymerase Chain Reaction Kỹ thuật nhân bản ADN PIC Polymorphism Information Hàm lƣợng thông tin đa hình Content QTLs Quantitative Trait Loci Locus tính trạng số lƣợng RAPD Radnom Amplified Polymophism Đa hình các đoạn ADN đƣợc DNA nhân bản ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Đa hình độ dài các đoạn cắt giới Polymorphism hạn RILs Recombinant Inbred Lines Dòng tái tổ hợp SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotide đơn SSR Simple Sequence Repeats Đa hình các đoạn lặp đơn giản v DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 3. Các giống lúa đƣợc dùng để xây dựng thƣ viện DArT markers. Phân nhóm mẫu giống theo thời gian sinh trƣởng. Phân nhóm mẫu giống theo số nhánh hữu hiệu.

Đặc điểm hình dạng hạt của các mẫu giống lúa Việt Nam trong bộ sƣu tập giống nghiên cứu. Chỉ số FST giữa các phân nhóm và mức ý nghĩa P-value. Đặc điểm của các phân nhóm trong hai nhóm giống thuộc loài phụ indica và japonica. Sự phân rã của LD trên 12 nhiễm sắc thể trong nhóm giống indica và japonica.

Kết quả phân tích ANOVA và hệ số di truyền theo nghĩa rộng của các tính trạng nghiên cứu. Các giá trị thống kê cơ bản của các tính trạng liên quan đến đặc điểm phát triển bộ rễ ở các mẫu giống nghiên cứu. Giá trị thống kê cơ bản của các tính trạng nghiên cứu theo 2 nhóm giống indica (ind) và japonica (jap). So sánh giá trị trung bình của các tính trạng giữa các phân nhóm thuộc nhóm giống indica và japonica.

Hệ số tƣơng quan giữa các tính trạng theo dõi ở cả tập đoàn và riêng cho từng nhóm giống indica và japonica. Danh sách các QTLs đã xác định đƣợc với P-value < 1E-04 ở cả tập đoàn và hai nhóm giống indica và japonica. Các QTLs liên kết với nhiều hơn một tính trạng nghiên cứu ở cả tập đoàn và hai nhóm mẫu giống thuộc loài phụ indica và japonica. Danh sách các gen ứng viên đã đƣợc khẳng định về vai trò và chức năng đối với sự phát triển bộ rễ.

Các giống lúa có kiểu hình tƣơng phản và haplotype khác biệt tại vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng NCR trên NST số 11. Danh sách các gen nằm trong vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng NCR trên NST số 11. 125 vi DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2. Thành phần rễ cấu trúc nên bộ rễ lúa.

Cấu trúc xuyên tâm của rễ lúa. Tổ chức mô theo chiều dọc và mô hình phân chia tế bào ở rễ lúa. Số lƣợng QTLs liên kết với đặc điểm bộ rễ ở lúa trên các vùng nhiễm sắc thể. Các bƣớc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger (a) và NGS (b) .