Luận án tiến sĩ tạo dòng bông gossypium hirsutum l chống chịu thuốc trừ cỏ glufo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ NHÃ TẠO DÒNG BÔNG (Gossypium hirsutum L.) CHỐNG CHỊU THUỐC TRỪ CỎ GLUFOSINATE VÀ GLYPHOSATE BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN QUA TRUNG GIAN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP. Hồ Chí Minh – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ NHÃ TẠO DÒNG BÔNG (Gossypium hirsutum L.) CHỐNG CHỊU THUỐC TRỪ CỎ GLUFOSINATE VÀ GLYPHOSATE BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN QUA TRUNG GIAN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.

PHAN THANH KIẾM TS. BÙI MINH TRÍ TP. Hồ Chí Minh – Năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận án hoàn toàn trung thực và là một phần trong đề tài “Nghiên cứu tạo giống bông kháng sâu và chịu thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật chuyển gen” mã số KC.11/11-15 thuộc Chương trình“Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ phục vụ sản xuất các sản phẩm chủ lực” do TS.

Trần Thanh Hùng và TS. Trịnh Minh Hợp làm chủ nhiệm. Những số liệu trong luận án được phép công bố với sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài và chưa từng được sử dụng để bảo vệ học vị nào. Tác giả của luận án Nguyễn Thị Nhã i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện luận án, tôi luôn nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của tập thể Quý thầy cô, các cơ quan và cá nhân.

Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS. Phan Thanh Kiếm và TS. Bùi Minh Trí là những người thầy hướng dẫn khoa học đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi thực hiện luận án; Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Bộ môn Công nghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP.

Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án; Tập thể Quý thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã hướng dẫn và giúp tôi thời gian thực hiện luận án tại Trường; Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố, Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu tạo giống bông kháng sâu và chịu thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật chuyển gen” mã số KC.11/11-15 đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất để thực hiện các nội dung nghiên cứu, Ban Giám hiệu Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành đã tạo điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành các yêu cầu của Cơ sở đào tạo; Tất cả bạn bè và đồng nghiệp những người đã dành cho tôi sự giúp đỡ chân thành trong quá trình làm luận án; Chồng, con cùng những người thân trong gia đình đã luôn động viên, ủng hộ và là điểm tựa tinh thần to lớn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Nhã ii TÓM TẮT Các thí nghiệm của Luận án “Tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) chống chịu thuốc trừ cỏ Glufosinate và Glyphosate bằng kỹ thuật chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens.” được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố-xã Nhơn Sơn-huyện Ninh Sơn-tỉnh Ninh Thuận, trên giống bông Coker310 và dòng Coker310FR; hai cấu trúc gen P35S-EPSPS-TNOS và PNOS-bar- TNOS; hai vector chuyển gen pCB301:nptII và pCAMBIA1300:hpt; và vi khuẩn A. tumefaciens chủng C58/PGV2260.

Thời gian thực hiện từ năm 2013 đến năm 2020. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là ứng dụng được phương pháp chuyển gen qua trung gian A.tumefaciens để chuyển gen EPSPS và bar vào cây bông và tạo được dòng bông chuyển gen chống chịu cao với thuốc trừ cỏ glyphosate/glufosinate. Kết quả cho thấy: Dòng Coker310FR chọn lọc qua tái sinh liên tục ba thế hệ của giống bông Coker310 có khả năng tái sinh rất cao, thể hiện qua tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi là 95,6% và tỷ lệ cây tái sinh không dị dạng trên môi trường GR5 là 36,7%. Bốn vector chuyển gen, gồm pCAMBIA1300:hpt-bar, pCAMBIA1300:hpt- EPSPS, pCB301:nptII-bar và pCB301:nptII-EPSPS được tái cấu trúc bằng cách chèn vùng P35S-EPSPS-TNOS và PNOS-bar-TNOS vào vector biểu hiện thực vật pCB301:nptII và pCAMBIA1300:hpt.

Kiểm tra hiện diện của 04 gen đích và gen độc lực virC khẳng định 04 vector chuyển gen được biến nạp thành công vào vi khuẩn A. tumefaciens chủng C58/PGV2260. Nhiễm mẫu thân mầm giống bông Coker310 với A. tumefaciens mang gen EPSPS và bar ở mật độ, thời gian lây nhiễm, thời gian và nhiệt độ đồng nuôi khác nhau có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ cảm ứng, sống sót và phát sinh phôi của mô sẹo chuyển gen.

Kết quả tốt nhất đạt được khi lây nhiễm vi khuẩn với mật độ o OD600 0,75 trong 10 phút, đồng nuôi cấy 64 giờ ở nhiệt độ 22 C. Tương tác giữa loại mẫu/giống với tác nhân chọn lọc ảnh hưởng đến tỷ lệ tái sinh và tỷ lệ cây mang gen chuyển. Hiệu quả chuyển vector pCAMBIA1300:bar vào mẫu lá mầm Coker310FR đạt cao nhất với 2,8% mô sẹo phát sinh phôi, 15,8 cây/mẫu được tái sinh, 76,0% số cây mang gen chuyển và 64,7% trong số đó hữu thụ. Hiệu iii quả chuyển vector pCB301:bar vào mẫu thân mầm Coker310FR đạt cao nhất với 2,1% mô sẹo phát sinh phôi, tái sinh được 20,6 cây/mẫu, 30,2% số cây mang gen chuyển và 82,5% trong số cây đó hữu thụ.

Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen bar B1, B9, B18 và BF8, BF17 mang 1 bản sao, có hoạt động phiên mã của gen chuyển, cây sinh trưởng đồng đều và có mức độ chống chịu thuốc trừ cỏ Glufosinate cao (0,6 kg ai. Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen EPSPS có 1 bản sao, có hoạt động phiên mã của gen chuyển và có mức độ chống chịu thuốc trừ cỏ Glyphosate là E7, E8, E19, EF14 và EF25, không có dòng chống chịu cao. Hai dòng bông chuyển gen T2 là B9 và BF17 mang 01 bản sao gen, di truyền gen chuyển theo quy luật Mendel, chống chịu cao với thuốc trừ cỏ Glufosinate ở nồng độ 0,6 kg ai./ha, không sai khác về đặc điểm thực vật học và khả năng chống chịu bệnh hại so với giống bông nền Coker310 không chuyển gen. iv SUMMARY The experiments of the thesis “Transformation of cotton plants (Gossypium hirsutum L.) for resisting to Glufosinate and Glyphosate herbicide using A.

tumefaciens-mediated transgenic technique” were conducted at Nha Ho Research Institute for Cotton and Agriculture Development, Nhon Son Commune, Ninh Son District, Ninh Thuan Province. The research was applied on the cotton Coker310 variety and the Coker310FR line; two gene structures P35S-EPSPS-TNOS and PNOS-bar-TNOS; two transgenic vectors pCB301:nptII and pCAMBIA1300:hpt; and A. tumefaciens strain C58/ PGV2260. The research was conducted from 2013 to 2018.

The research objective was to apply A.tumefaciens-mediated gene transfer method for transferring EPSPS and bar genes into cotton plants to create transgenic cotton lines which are high resistant to Glyphosate/Glufosinate herbicide. The results showed that: The Coker310FR line selected through three generation-regeneration of Coker310 cotton variety expressed a very high regeneration capacity, with the rate of callus-embryogenesis was 95.6% and the rate of normal regenerated plants growing on GR5 medium was 36. Four transgenic vectors, including pCAMBIA1300:hpt-bar, pCAMBIA1300: hpt-EPSPS, pCB301:nptII-bar and pCB301:nptII-EPSPS were reconstructured by inserting the regions P35S-EPSPS-TNOS and PNOS-bar-TNOS into plant- expressed vector pCB301:nptII and pCAMBIA1300:hpt. The test for presence of 04 target genes and the virulent gene VirC confirmed that 04 transgenic vectors were successfully transformed into A.

tumefaciens strain C58/PGV2260. The infection of A. tumefaciens containing EPSPS and bar genes on hypocotyl explants of the Coker310 plants at different densities, infection times, duration and temperatures significantly affected the rates of induction, survival and embryogenesis of transgenic callus. The best results were bacterial infection at a density of OD600 0.75 for 10 minutes, co-culture for 64 hours at 22 °C.

v The interaction between explant type/variety and the selection agents affected the rate of regeneration as well as rate of plants containing transgenes. The efficiency of transferring pCAMBIA1300:bar vector into Coker310FR cotyledon explants reached the highest rate of embryo-generated callus at 2.8 plants per explant were successfully regenerated, 76.0% of plants containing transgenes and 64.7% of them were fertility. The efficiency of transferring pCB301:bar vector into Coker310FR hypocotyl explants was highest with 2.1% of callus generated embryos, regenerating 20.6 plants per explant, 30.2% of them were transgenic plants in which 82. The combination of molecular and biological assessments resulted in the selection of 5 lines, i.

All of these lines were uniform growth plants containing single copy which expressed transcription activities of target genes and shown a high level of tolerance to Glufosinate. The combination of molecular and biological assessments resulted in the selection of 5 lines, i. E7, E8, E19, EF14 and EF25. All of these lines were uniform growth plants containing single copy which expressed transcription activities of target genes and shown a moderate level of tolerance to Glyphosate.

Two T2 transgenic cotton lines, i. B9 and BF17, carried one copy of the gene, which genetically followed the Mendel's rules. These transgenic lines were highly resistant to Glufosinate herbicide at a concentration of 0./ha, had no difference in botanical characteristics and disease resistance in comparison with original non-transgenic Coker310 cotton plant. vi KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 1-PPT Phosphinothricin 2,4-D 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid A.

tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AHAS Acetohydroxyacid synthase ALS Kháng thuốc gốc sulfonylurea aph(3’)-II Aminoglycoside 3’-phosphotransferase II RNA Ribonucleic acid Arabidopsis Arabidopsis thaliana AS acetosyringone ASA American Soybean Association -Hiệp hội Đậu nành Mỹ BA Benzyladenine BVTV Bảo vệ Thực vật bar Bialaphos BĐG Biến đổi gen CAAS Chinese Academy of Agricultural Sciences-Học viện Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc Cb Carbenicillin CERA Center for environmental risk assessment-Trung tâm đánh giá rủi ro môi trường CI Callus induction-Cảm ứng mô sẹo CNSH Công nghệ Sinh học CP Môi trường nhân phôi ctv Cộng tác viên DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphate E.coli Escherichia coli EFSA European Food Safety Authority vii EI Embryogenesis induction-ký hiệu môi trường cảm ứng phát sinh phôi EP Môi trường nuôi phôi EPSP 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase-Gen mã hóa enzyme 5-enolpyruvyl-shikimate-3- phosphate (EPSP) synthase EU European Union FAO Food and Agriculture Organization-Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc GAA Gaelic Athletic Association GE Genetic engineering gfp Green fluorescent protein-protein huỳnh quang GM Gene modification GMP Good Manufacturing Practice GNA Galanthus nivalis agglutinin GOI Genes of interest GR Germination regeneration- môi trường nẩy mầm, tái sinh cây GUS Glucuronidase hpt Hygromycin phosphotransferase HR Herbicide resistance-Tính kháng thuốc trừ cỏ HT Herbicide tolerance-Tính chống chịu thuốc trừ cỏ Hv Hordeum vulgare L. Hygromycin B IAA indole-3-acetic acid IARC International Agency for Research on Cancer IBA Indole-3-butyric acid ICAC (International Cotton Advisory Committee) Ủy ban Tư vấn bông Quốc tế viii ISAAA Acquisition of Agri-biotech Applications ISB Information systems for biotechnology-hệ thống thông tin công nghệ sinh học IR Insecticide Resistance-Tính kháng thuốc diệt côn trùng JAAS Jiangsu Academy of Agriculture Sciences-Học viện Khoa học Nông nghiệp Jiangsu Ka.