Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm a lưu hành tại miền bắc việt nam 200

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------- HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2014 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------- HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số : 62.15 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Đặng Đức Anh 2. Lê Thị Quỳnh Mai HÀ NỘI – 2014 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Vũ Mai Phương iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:  Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.  Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu. Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành quả ngày hôm nay. Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013 HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG v MỤC LỤC Trang phụ bìa.

i Lời cam đoan. ii Lời cảm ơn. iii Mục lục. iv Chữ viết tắt.

vii Danh mục bảng. viii Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ. ix ĐẶT VẤN ĐỀ. 1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN.

Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A.

Khả năng gây bệnh của vi rút cúm. Tiến hóa của vi rút cúm A. Phòng và điều trị cúm A. Văc xin phòng cúm.

Thuốc điều trị vi rút cúm A. Các thuốc kháng vi rút mới. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine.

Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm.

Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm. 34 CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm. Kỹ thuật xét nghiệm. Phân tích số liệu.

51 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A.

Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012. Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn nghiên cứu. 72 vii CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN.

Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50). Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam. Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian.

103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems Association of Public Health Laboratories APHL (Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng) ATSH An Toàn Sinh Học DNA Deoxiribonucleic Acid Global Influenza Surveillance and Response System GISRS (Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu) IC50 Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút) IQR Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị) International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về ISIRV-AVG cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi rút) Kb Kilobase NAI Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase) National Institute of Infectious Diseases - Japan NIID (Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản) PCR Polymerase Chain Reaction pdm Pandemic PTN Phòng Thí Nghiệm RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới United States- Centers for Disease Control and Prevention US-CDC (Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) ix DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A. Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu. Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn.

Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011. Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012. Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008.

Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm đột biến. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen). 71 x DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình Tên hình Trang 1.

Cấu trúc vi rút cúm. Hình ảnh vi rút cúm. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm.

Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào.

Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1pdm09. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1.

Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 – nhóm 2, 2001-2009. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009.

Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm 2, 2001-2009. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1.

Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 2. Quá trình phân lập vi rút cúm. Quá trình xác định giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm.

45 Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên cứu. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu.

Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên cứu. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên cứu. Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012. 86 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở Việt Nam.

Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người. Các vụ dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013.