Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc rnai chứa đoạn gen cpi của hai loài s

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM -------- LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM -------- LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.21 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS. TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, một số kết quả cộ. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên Tạp chí Khoa học-Công nghệ đồng tác giả, phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thu Hiền, Trƣờng Đại học Y-Dƣợ ững ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệ ề tài luận văn.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm –Đại học Thái Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng – KTV phòng Công nghệ tế bào thực vật, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu K & Nhân văn miền núi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành khoá học. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến bố mẹ, anh chị cùng bạn bè đã động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tác giả Lê Thị Hồng Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN………………………………………………………….

i LỜI CAM ĐOAN………………………………………………………. ii MỤC LỤC……………………………………………………………… iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ……………. v DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………. vii DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………… viii MỞ ĐẦU…………………………………………………………….

TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………. Cây đậu tƣơng……………………………………………………… 3 1. Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của đậu tƣơng…………… 3 1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và trong nƣớc……….

Bệnh khảm và virus gây bệnh khảm SMV, BYMV………………. Bệnh khảm đậu tƣơng……………………………………………. Virus gây bệnh khảm SMV và BYMV…………………………. Kỹ thuật RNAi…………………………………………………….

Cơ chế ức chế gen của kỹ thuật RNAi…………………………… 12 …. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vào mô đích…………. Chuyển gen gián tiếp thông qua A. Hệ thống tái sinh và hệ thống chọn lọ ……….

22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP…………………………. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ…………………………. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………….

Phƣơng pháp tạo vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp……………. Phƣơng pháp gây tổn thƣơng nách lá mầm………………………. Phƣơng pháp tái sinh cây đậu tƣơng từ nách lá mầm…………….

Phƣơng pháp lây nhiễm và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen………. Phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen……………………………. Phƣơng pháp xác định hiệu suất chuyển gen……………………. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.

KẾT QUẢ TẠO A. TUMEFACIENS MANG VECTOR CHUYỂN GEN pK7GW-CPi (SMV-BYMV)……………………………………. Tái sinh in vitro và chuyể - 41 giống đậu tƣơng ĐT12 và DT2008. 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.

52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine Bp Base pair (cặp base) BYMV Bean yellow mosaic virus CCM Cocultivation medium CP Coat protein (protein vỏ) CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide cs Cộng sự ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid Food and Agriculture Organization of the United Nations FAO (Tổ chức lƣơng thực và nông nghiệp liên hợp quốc) GA3 Gibberellic acid GM Môi trƣờng nảy mầm gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base Km Kanamycin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid PCR Polymerase chain reaction RISC RNA-inducing silencing complex RM Môi trƣờng ra rễ RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference SIM Môi trƣờng tạo chồi SEM Môi trƣờng kéo dài chồi siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Ti- plasmid Plasmid tạo khối u T0,T1 Các thế hệ cây đậu tƣơng chuyển gen T0 Cây đậu tƣơng chuyển gen tái sinh chồi T1 Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1 Vir Virulence Region v/p Vòng/phút YEP Yeast extract peptone Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới từ năm 2008 đến 2012…………………………………………………………. ậu tƣơng củ ố nƣớc đứng đầu thế giớ 2010, 2011, 2012 8 Bảng 1.

Sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2007 – 2013……………. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro……………… 29 Bảng 2. Thành phần đệm tách DNA tổng số………………………… 32 Bảng 2. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.

Thành phần của phản ứng PCR. Ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm đến khả năng tạo đa chồi……………………………………. Khả năng phát sinh chồi, kéo dài chồi và khả năng ra rễ của hai giống ĐT12 và DT2008 trong quá trình chuyển gen. 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.

Cấu trúc hệ gen của SMV…………………………………. Cơ chế RNA can thiệp………………………………………. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tƣơng… 30 Hình 3.

Kết quả điệ ản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc……………………………………………………. Kết quả gây tổn thƣơng, tạo đa chồi nách lá mầm bằng các phƣơng thức khác nhau ở hai giống ĐT12 và DT2008……. Kết quả tái sinh và chuyển gen ở giống đậu tƣơng ĐT12 và DT2008. Kết quả tỷ lệ tạo đa chồi, kéo dài chồi và đƣa cây ra giá thể… 45 Hình 3.

ổng số tách từ Đ 2008. ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấ - ậu tƣơng chuyể 12. ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trú - ậu tƣơng chuyể 2008. 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ MỞ ĐẦU 1.

Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), đây là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị dinh dƣỡng và kinh tế cao. Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê chính thức của Chính phủ, đậu tƣơng đƣợc trồng ở 25 tỉnh trên cả nƣớc, trong đó 65% ở miền Bắc và 35% ở miền Nam. Tuy nhiên, sản lƣợng đậu tƣơng vẫn còn thấp và còn phải nhập khẩu từ các nƣớc khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [54]. Hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển của đậu tƣơng là dễ bị nhiễm virus, các bệnh do virus gây ra thƣờng không gây chết cây nhƣng làm giảm năng suất và chất lƣợng của cây trồng.

Bệnh khảm lá đậu tƣơng và khảm vàng đậu tƣơng là hai bệnh hại có triệu chứng gần giống nhau, xuất hiện phổ biến ở cây đậu tƣơng do soybean mosaic virus (SMV) và bean yellow mosaic virus (BYMV) gây ra. virus này thuộc nhóm potyvirus, có vật liệu di truyền là sợi đơn RNA [56]. Chúng lan truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới, số lƣợng vật chủ trung gian càng nhiều thì tỷ lệ nhiễm bệnh càng lớn, bệnh xuất hiện càng sớm thì sẽ dẫn đến thất thu càng nặng. Những biện pháp thƣờng sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ mà không thể chống lại triệt để.

Hiện nay, nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, ngƣời ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh bằng cách đƣa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gen) của virus vào hệ gen của thực vật. hành công đầu ở cây thuốc lá và cây cà chua kháng lại virus khảm thuốc lá, đu đủ kháng lại virus bệnh đốm vòng. Bên cạnh đó, kỹ thuật RNAi (RNA interference) đƣợc biết đến là một kỹ thuật hiện đại và chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Cấu trúc RNAi chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ virus mục tiêu đƣợc sử dụng để chuyển vào cây, nó sẽ đƣợc biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen và kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây.

Nhiều giống cây trồng kháng đƣợc các loại bệnh virus khác nhau đã đƣợc tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi, nhƣ cây đậu tƣơng chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%, cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 lo i virus này [5], [13], [26]. Đây là tiền đề quan trọng giúp mở ra khả năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên các loại cây trồng quan trọng khác [55]. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV”. Mục tiêu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu cấu trúc RNAi A. tumefaciens vi khuẩn tái tổ hợp; 3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm đạt hiệu quả tạo đa chồi và kéo dài chồi cao nhất; 3. Lây nhiễm vi khuẩn A.

tumefaciens tái tổ hợp vào mô nách lá mầm và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen; 3. Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full