Nghiên cứu sinh tổng hợp thu nhận carotenoids từ vi sinh vật và bước đầu chuyển

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận này là công trình do tôi tự làm và nghiên cứu, các trích dẫn đều đã ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Nếu có bất kỳ vần đề gì liên quan, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Ngƣời viết khóa luận Nguyễn Ngọc Diệp i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Hoài Trâm là ngƣời hƣớng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi nghiên cứu, hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ trong Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein, Viện Công nghiệp thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và chia sẻ với tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài.

Nhân dịp này, tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh cùng các thầy giáo, cô giáo, cán bộ Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo những điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Hà Nội, tháng 9 năm 2012 Nguyễn Ngọc Diệp ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B. trispora Blakeslea trispora Rhodo.

Rhodotorula PDA Potato dextrose agar YMA Yeast malt agar LOX Lipoxygenases XO Xanthine oxidase EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid FDI Flame Ionization Detector GC Gas chromatography TLC Thin layer chromatography HPLC High-performance liquid chromatography UV/VIS Ultraviolet-visible spectrophotometry psu practical salinity unit lux lm/m2 : đơn vị đo cƣờng độ ánh sáng iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Dữ liệu hấp thụ của β-carotene và lycopene .2: Hàm lƣợng carotenoids và β-carotene tạo thành từ các chủng nấm men Rhodotorula .1: Kết quả tổng hợp β - carotene từ sinh khối nấm men, nấm sợi .2: Hàm lƣợng β-carotene theo HPLC từ sinh khối nấm sợi B.3: Kết quả lên men tổng hợp sinh khối nấm sợi B.4: Lựa chọn phƣơng pháp tách chiết β-carotene từ sinh khối B.5: Kết quả tách chiết β-carotene từ sinh khối nấm sợi B.6: Hàm lƣợng β-carotene trƣớc và sau khi cô đặc.7: Sự phân rã β-carotene tổng hợp trong quá trình tự oxy hóa .8 : Sự phân rã β-carotene tổng hợp trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase .9 : Hàm lƣợng các chất thơm tạo thành trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase .10: Sự phân rã β-carotene trong quá trình tự oxy hóa β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.11: Hàm lƣợng các chất thơm đƣợc hình thành trong quá trình tự oxy hóa β- carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.12: Sự phân rã β-carotene sinh khối nấm sợi B. trispora trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase .13: Hàm lƣợng các chất thơm tạo thành chất thơm trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase .14: Sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B. trispora trong quá trình đồng oxy hóa sử dụng enzyme XO ở các nồng độ khác nhau .15: Tỉ lệ % β-carotene chuyển hóa thành chất thơm trong quá trình đồng oxy hóa β-carotene từ sinh khối nấm sợi B. trispora với các nồng độ XO và cơ chất acetaldehyde khác nhau .16: Hàm lƣợng các chất thơm tạo thành trong quá trình đồng oxy hóa β-carotene từ sinh khối nấm sợi B.

trispora với các dung môi tách chiết khác nhau. 72 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Phổ hấp thụ của một số carotenoids .2: Nấm men Rhodotorula glutinis .3: Tảo Dunaliella salina .4: Chu kì sinh sản vô tính và hữu tính của Blakeslea trispora .5: Quá trình hình thành β– carotene từ nấm sợi .6: Cấu trúc một số chất thơm sau khi phân cắt β-carotene .7: Sự tạo thành chất thơm nhờ quá trình phân rã β-carotene .8: Cấu trúc tinh thể enzyme Xanthine oxidase tách chiết từ bơ sữa bò .9: Cơ chế của quá trình chuyển hóa bởi enzyme xanthine oxidase .1: Khuẩn lạc và tế bào nấm men Rhodotorula B18. 44 Bào tử và hệ sợi của Blakeslea trispora (B1, B2).2: Quang phổ hấp thụ từ sinh khối Rhodotorula RH2, B18.3: Quang phổ hấp phụ của β-carotene từ sinh khối B.5: Sắc ký đồ HPLC của WH1, WH2.6: Túi bào tử của B. trispora nuôi cấy trên môi trƣờng thạch.7: Hệ sợi và bọng màu chứa β-carotene của nấm sợi B.8: Động học phân rã β-carotene từ β-carotene tổng hợp trong quá trình tự oxy hóa và đồng oxi hóa sử dụng enzyme XO .9: Động học phân rã β-carotene từ β-carotene tách chiết ở sinh khối nấm sợi Blakeslea trispora trong quá trình tự oxy hóa và đồng oxi hóa sử dụng enzyme XO .10: Sự thay đổi hàm lƣợng β-carotene từ các nguồn khác nhau .11: Sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.trispora trong quá trình đồng oxy hóa sử dụng enzyme XO ở các nồng độ khác nhau .12: Tỉ lệ % β-carotene chuyển hóa thành β-cyclocitral với các nồng độ enzyme và cơ chất khác nhau .13: Tỉ lệ % β-carotene chuyển hóa thành β-ionone với các nồng độ enzyme và cơ chất khác nhau .14: Tỉ lệ % β-carotene chuyển hóa thành DHA với các nồng độ enzyme và cơ chất khác nhau.

70 vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT. iii DANH MỤC BẢNG .iv DANH MỤC HÌNH .vi MỞ ĐẦU .i CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN. Khái quát về Carotenoids.

Nguồn gốc, cấu trúc và tính chất carotenoids. Ứng dụng của carotenoids /β-carotene. Vi sinh vật tổng hợp carotenoids/ β-carotene. Nấm men, tảo và các điều kiện tổng hợp carotenoids.

Nấm sợi và các điều kiện tổng hợp carotenoids. Chuyển hóa sinh học carotenoids/β-carotene thành các chất thơm. Giới thiệu về các chất thơm dẫn xuất từ carotenoids/ β – carotene. Các nghiên cứu về chuyển hóa sinh học carotenoids thành các thành phấn hƣơng thơm.

25 CHƢƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP. Vi sinh vật và phƣơng pháp nuôi cấy. Vật liệu, hóa chất, môi trƣờng. Thiết bị, dụng cụ.

Phƣơng pháp nghiên cứu. Phƣơng pháp lên men tổng hợp sinh khối nấm men, nấm sợi giàu β – carotene. Phƣơng pháp thu nhận, tách chiết β–carotene từ sinh khối nấm men, nấm sợi. Phƣơng pháp chuyển hóa sinh học β-carotene thành các thành phần hƣơng thơm.

Phƣơng pháp phân tích. Phƣơng pháp quang phổ. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng.

Phân tích các thành phần chất thơm bằng sắc kí khí (GC). 42 PHẦN 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Kết quả tổng hợp, phân tích và tách chiết β-carotene từ nấm men, nấm sợi. Kết quả tổng hợp β - carotene từ sinh khối nấm men, nấm sợi.

Kết quả phân tích β - carotene từ sinh khối nấm men, nấm sợi. Kết quả nghiên cứu tổng hợp, tách chiết và thu nhận β - carotene từ nấm sợi Blakeslea trispora. Bƣớc đầu nghiên cứu sự chuyển hóa sinh học β-carotene thành các thành phần chất thơm. Khảo sát sự phân rã β-carotene và tạo các chất thơm từ các carotenoids có nguồn gốc khác nhau.

Bƣớc đầu nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ enzyme XO và cơ chất acetaldehyde đến sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B. trispora và hình thành chất thơm trong quá trình đồng oxy hóa. Bƣớc đầu khảo sát lựa chọn dung môi tách chiết chất thơm. 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

74 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 81 ix MỞ ĐẦU Từ lâu, việc sử dụng các thảo mộc thơm đã trở thành một phần thiết yếu trong cuộc sống hàng ngày của nền văn hóa cổ xƣa. Ngày nay, con ngƣời vẫn luôn khao khát tìm ra những nguồn hƣơng liệu để phục vụ cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm. Những năm qua, nhiều loại chất thơm đã đƣợc xác định rõ về cấu tạo cũng nhƣ tính chất hoá học.

Các hợp chất này đƣợc tìm thấy trong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩm lên men tự nhiên. Tuy nhiên việc tách, chiết chúng là một việc khó khăn đòi hỏi một quy trình phức tạp và ít hiệu quả kinh tế. Một trong các lĩnh vực đang nổi lên về sản xuất các hợp chất là sử dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng enzyme và vi sinh vật cho sự xúc tác sinh học Các chất thơm tạo thành theo con đƣờng này đƣợc gọi là ―tự nhiên‖ bởi chúng đƣợc tạo ra thông qua hoạt tính sinh học tự nhiên (enzyme và vi sinh vật) và nhờ đó, tỷ lệ các đồng phân (Isomers) và đồng vị (Isotops) của các chất thơm này có thể so sánh đƣợc với sản phẩm chiết xuất từ tự nhiên, không nhƣ các chất đƣợc tổng hợp bằng quá trình hóa học. Và mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trong việc tạo ra các chất thơm tự nhiên nhƣng chỉ có một số ít các cấu tử thơm đƣợc tạo ra bằng con đƣờng sinh học, trong số đƣợc quan tâm nhiều nhất là các chất thơm có nguồn gốc từ carotenoids mà đặc biệt là từ β-carotene.

Chúng có tiềm năng tạo hƣơng thơm cao và do đó là mối quan tâm lớn cho các ngành công nghiệp hƣơng liệu và nƣớc hoa. Các hợp chất thơm có nguồn gốc từ carotenoids đƣợc phân phối rộng rãi trong tự nhiên và là tiền thân của nhiều hƣơng liệu quan trọng trong thực phẩm nhƣ trái cây và hoa nhƣ β-ionone, β-cyclocitral, dihydroactinidiolide (DHA), β-damascenone… Chúng có mùi hƣơng hoa, quả và gỗ rất mạnh, là thành phần chính của nhiều tổ hợp hƣơng thơm đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Chúng tồn tại với hàm lƣợng rất thấp trong mô tế bào thực vật, vì vậy sự tách chiết rất tốn kém. Điều đó đặt ra những nghiên cứu phát triển những công nghệ khác để thu nhận chúng.

i Carotenoids/β-carotene có trong nhiều loài thực vật nhƣ cà chua, cà rốt, gấc…, trong vi sinh vật nhƣ Dunaliella salina, nấm sợi Blakeslea trispora, nấm men đỏ Rhodotorula glutinis, Rhodotorula rubra, Rhodotorula sp. Do đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu sinh tổng hợp, thu nhận carotenoids từ vi sinh vật và bƣớc đầu chuyển hóa sinh học thành các thành phần hƣơng thơm”. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu Mục tiêu đề tài Nghiên cứu sinh tổng hợp, thu nhận carotenoids từ vi sinh vật và bƣớc đầu chuyển hóa sinh học thành các thành phần hƣơng thơm. Nội dung nghiên cứu 1.

Nghiên cứu lựa chọn vi sinh vật có khả năng tạo carotenoids/β-carotene với hàm lƣợng cao 2. Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện để tổng hợp và thu nhận carotenoids/β- carotene từ chủng vi sinh vật đó trên quy mô phòng thí nghiệm. Bƣớc đầu nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp để chuyển hóa sinh học β- carotene thành các thành phần chất thơm. 2 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.

Khái quát về Carotenoids 1.