Phân lập tuyển chọn và khảo nghiệm các dòng vi khuẩn azospirillum nội sinh trên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀO THANH HOÀNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO NGHIỆM CÁC DÒNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM NỘI SINH TRÊN SINH TRƯỞNG VÀ NĂNG SUẤT CỦA LÚA CAO SẢN TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÙ SA NGỌT TẠI TỈNH AN GIANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CẦN THƠ - NĂM 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀO THANH HOÀNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO NGHIỆM CÁC DÒNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM NỘI SINH TRÊN SINH TRƯỞNG VÀ NĂNG SUẤT CỦA LÚA CAO SẢN TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÙ SA NGỌT TẠI TỈNH AN GIANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ: 62420107 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. NGUYỄN HỮU HIỆP CẦN THƠ - NĂM 2014 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .vi DANH SÁCH BẢNG. vii DANH SÁCH HÌNH.x CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU.1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 KHÁI QUÁT VỀ CÂY LÚA .1 Phân loại cây lúa.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG PHÂN BÓN .1 Tình hình sử dụng phân bón vô cơ .2 Tình hình sử dụng phân bón sinh học .3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LÚA GẠO TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .4 KHÁI QUÁT NÔNG NGHIỆP TỈNH AN GIANG .5 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN AZOSPIRILLUM .1 Phân loại vi khuẩn Azospirillum .2 Đặc tính hình thái, sinh lý của vi khuẩn Azospirillum .3 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Azospirillum .1 Đặc tính cố định đạm của vi khuẩn Azospirillum .2 Đặc tính sử dụng nguồn carbon của vi khuẩn Azospirillum .3 Đặc tính sử dụng acid amin của vi khuẩn Azospirillum .4 Đặc tính khử acetylene của vi khuẩn Azospirillum .5 Đặc tính tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng của Azospirillum.6 Đặc tính sinh thái của vi khuẩn Azospirillum .4 Gen nif của vi khuẩn Azospirillum .1 Gen nif của Azospirillum.2 Cấu trúc gen nifH của vi khuẩn Azospirillum .3 Chức năng gen nif của Azospirillum.5 Tính đa dạng của enzyme cố định đạm nitrogenase .1 Cấu trúc, chức năng enzyme nitrogenase .2 Các yếu tố hạn chế biểu hiện của enzyme nitrogenase .6 HỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AZOSPIRILLUM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM.7 KỸ THUẬT PCR .1 Khái quát về kỹ thuật PCR.2 Trình tự các bước thực hiện phản ứng PCR .48 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .2 Vật liệu thí nghiệm .3 Hóa chất thí nghiệm.4 Địa điểm thí nghiệm .2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản và lúa hoang.1 Môi trường nuôi vi khuẩn Azospirillum .2 Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản trồng và lúa hoang .2 Xác định đặc tính hình thái và định danh vi khuẩn Azospirillum bằng kỹ thuật sinh học phân tử .1 Đặc tính hình thái và chuyển động của vi khuẩn Azospirillum .2 Xác định kích thước tế bào vi khuẩn Azospirillum .3 Xác định Gram của vi khuẩn Azospirillum.4 Định danh các dòng vi khuẩn Azospirillum .3 Tuyển chọn Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở phòng thí nghiệm .1 Môi trường dung dịch trồng cây.2 Trồng lúa cao sản ở phòng thí nghiệm .3 Thu mẫu lúa và phân tích các chỉ tiêu nông học .4 Trắc nghiệm độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa cao sản trồng trong nhà lưới .1 Trồng lúa cao sản trong nhà lưới.2 Thu mẫu lúa và phân tích các chỉ tiêu nông học .5 Trắc nghiệm độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa cao sản trồng ngoài đồng ruộng .1 Trồng lúa cao sản ngoài đồng ruộng .2 Thu mẫu lúa và phân tích các chỉ tiêu nông học .62 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản và lúa hoang .1 Nguồn gốc của các mẫu lúa hoang và lúa cao sản .2 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Azospirillum .3 Môi trường nuôi vi khuẩn Azospirillum .2 Đặc tính hình thái và định danh các dòng vi khuẩn Azospirillum .1 Đặc tính hình thái của vi khuẩn Azospirillum.1 Hình dạng và chuyển động của vi khuẩn Azospirillum .2 Kích thước khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Azospirillum.3 Xác định Gram của vi khuẩn Azospirillum.2 Định danh các dòng vi khuẩn Azospirillum .1 Định danh vi khuẩn Azospirillum bằng kỹ thuật PCR.2 Phân tích gel sản phẩm PCR .3 Tuyển chọn vi khuẩn Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở phòng thí nghiệm .2 Chiều cao cây lúa.3 Chiều dài rễ lúa sau khi thu hoạch .4 Hàm lượng đạm tổng số của cây lúa .4 Độ hữu hiệu của vi khuẩn Azospirillum trên lúa cao sản trồng trong nhà lưới.1 Độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa OM 6976 trồng trong nhà lưới .1 Chiều cao cây lúc 30 ngày và lúc thu hoạch.2 Trọng lượng khô (TLK) thân lá và trọng lượng (TL) 1.3 Số hạt trên bông lúa và hàm lượng đạm trong hạt lúa.4 Độ hữu hiệu của vi khuẩn Azospirillum .2 Độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa OM 4218 trồng trong nhà lưới .1 Màu lá và trọng lượng khô thân lá .2 Chiều cao cây lúc 30 ngày và lúc thu hoạch.3 Số hạt/bông lúa và trọng lượng 1.4 Độ hữu hiệu của vi khuẩn Azospirillum .5 Độ hữu hiệu của vi khuẩn Azospirillum trên lúa cao sản trồng ngoài đồng ruộng.1 Độ hữu hiệu của vi khuẩn Azospirillum trên lúa OM 6976 trồng ngoài đồng.1 Màu lá và chiều cao cây lúc 45 ngày sau khi sạ (NSKS) .2 Các chỉ tiêu nông học lúc thu hoạch lúa.2 Độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa OM 4218 trồng ngoài đồng .1 Các chỉ tiêu nông học của lúa lúc 45 ngày sau khi sạ (NSKS).2 Các chỉ tiêu nông học lúc thu hoạch lúa.96 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .100 TÀI LIỆU THAM KHẢO.102 iii TÓM TẮT Sáu mươi mẫu lúa (48 mẫu lúa cao sản và 12 mẫu lúa hoang mọc lẫn trong ruộng lúa cao sản) được thu thập để phân lập vi khuẩn cố định đạm Azospirillum. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn Azospirillum có màu trắng đục, trắng trong, vàng nhạt; hình dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi cao (hay lài); tròn, bìa nguyên, nhầy, độ nổi cao (hay lài); tế bào dạng que ngắn.

Vi khuẩn Azospirillum dùng chủng cho lúa cao sản OM 6976 và OM 4218 trồng tại huyện Châu Phú, tỉnh An Giang nhằm xác định hiệu quả của các dòng vi khuẩn đã phân lập được. Kết quả có 04 dòng vi khuẩn Azospirillum sp. 7R, và Azospirillum sp. 25HR được định danh trong tổng số 60 dòng vi khuẩn Azospirillum đã được phân lập.

Khi chủng riêng lẻ 04 dòng vi khuẩn Azospirillum sp. cho lúa cao sản OM 6976 và OM 4218 trồng trong nhà lưới tại huyện Châu Phú, tỉnh An Giang, các dòng vi khuẩn này giúp lúa gia tăng chiều cao cây (24,5-34,6%, 20,0-21,7%), trọng lượng khô của cây (36,1- 146,4%, 83,5-92,9%), số hạt trên bông (172,0-218,8%, 60,7-61,2%), so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn Azospirillum sp. và không bón đạm. Hàm lượng đạm trong hạt lúa ở những nghiệm thức có chủng vi khuẩn Azospirillum sp.

đều cao hơn 2,5-3,9% so với nghiệm thức đối chứng. Ở các nghiệm thức có chủng vi khuẩn Azospirillum sp.000 hạt cao hơn (5,7-6,7%, 21,1-23,2%) so với nghiệm thức đối chứng. Ứng dụng 02 dòng Azospirillum sp. 6T1 và Azospirillum sp.

25HR khi chủng cho lúa cao sản (OM 6976 và OM 4218) trồng trên đất phù sa ở điều kiện đồng ruộng tại huyện Châu Phú, tỉnh An Giang để xác định hiệu quả cố định đạm của hai dòng vi khuẩn lên sự phát triển và năng suất lúa. Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi chủng kết hợp cùng lúc 02 dòng vi khuẩn này đã giúp lúa gia tăng chiều cao cây (6,6-7,9%, 17,7-20,9%), chiều dài bông (1,3-4,4%, 4,9-13,6%) số hạt trên bông (15,2-61,2%, 10,2-23,5%), trọng lượng 1.000 hạt (1,5-5,6%, 8,1- 8,5%), trọng lượng khô thân lá (2,8-56,9%, 28,6-57,1%) cao hơn so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn Azospirillum sp. và không bón đạm. Hàm lượng đạm trong hạt lúa ở những nghiệm thức có chủng 02 dòng vi khuẩn Azospirillum sp.

cao hơn so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn Azospirillum sp. Ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn Azospirillum sp. năng suất lúa cao hơn so với nghiệm thức đối thức đối chứng không chủng vi khuẩn và không bón đạm (55,0-55,2%, 55,5-55,7%). Từ kết quả thí nghiệm cho thấy, chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum sp.

giúp thay thế đạm (50-75 kgN/ha, 50KgN/ha). Từ khóa: Azospirillum, phân lập, vi khuẩn cố định đạm, lúa cao sản OM 6976, lúa cao sản OM 4218, lúa hoang. iv ABSTRACT Sixty samples rice (forty-eight samples of high yield rice and twelve samples wild rice appeared in cultivated rice field) were collected to isolate nitrogen- fixing bacterium Azospirillum. Ecology of colonies and cells of bacterium Azospirillum are milky-white, white, yellowish; in a circular form, the cover material, high buoyancy (or interest); round, cover materials, mucous, high buoyancy (or interest); short rod-shaped cells.

These bacteria were applied to the high yield rice OM 6976 and OM 4218 grown in Chau Phu District, An Giang Province in order to estimate the efficiency of the isolated bacterial strains. The results showed that 4/60 strains including Azospirillum sp. 7R, and Azospirillum sp. 25HR were identified.

When these four strains were applied separately to the high yield rice OM 6976 and OM 4218 grown in pots in a greenhouse in Chau Phu District, An Giang Province, they enabled the rice to increase their height (24.9%), the number of full grains on blossoms (172.2%), in comparision to Azospirillum sp. The nitrogen content of rice grains in inoculated Azospirillum sp. treatments was higher 2.9% than those of Azospirillum sp. 1000-seed weight of inoculated Azospirillum sp.

treatments was higher (5.2%) than those of nitrogen and Azospirillum sp. 6T1 and Azospirillum sp. 25HR were applied to the high crop yield rice (OM 6976 and OM 4218) grown in alluvial soil in Chau Phu District, An Giang Province to determine their effectiveness on the growth and yield of rice. The results showed that these two bacterial strains Azospirillum sp.

enabled the inoculated rice increased their height (6.9%), length of blossoms (1.6%), the number of full grains on blossoms (15.5%), dry weight of plant (2.1%) compared to those of Azospirillum sp. The nitrogen content of rice grains in Azospirillum sp. treatments was higher 6.0% than those of Azospirillum sp. Yield of rice inoculated with Azospirillum sp.

treatments was higher than those nitrogen and Azospirillum sp. The experimental results showed that the combination of two nitrogen-fixing bacterial strains Azospirillum sp. helped replace nitrogen (50-75 KgN/ha, 50KgN/ha). Key words: Azospirillum, isolate, nitrogen-fixing bacterium, high yield rice OM 6976, high yield rice OM 4218, wild rice.

v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A: Azospirillum. ADN: Acid Deoxyribo Nucleic. AzoCR: Vi khuẩn Azospirillum ở rễ lúa cao sản AzoCT: Vi khuẩn Azospirillum ở thân lúa cao sản AzoHR: Vi khuẩn Azospirillum ở rễ lúa hoang. AzoR: Vi khuẩn Azospirillum ở rễ lúa.

AzoT: Vi khuẩn Azospirillum ở thân lúa. Biofertilizer: Phân sinh học. CFU: Colony-Forming Unit. CPS: Capsular polysaccharide.

CV: Coefficient of Variation. EM: Effective Microorganisms. EPS: Exo-polysaccharide. FAO: Food and Agriculture Organization.

GDP: Gross Domestic Product. IAA: Indole-3-Acetic Acid. LSD: Least Significant Difference. MA: Mẫu Anh.

NFb: Nitrogen Free brothymol. NPK: Nitrogen - Phosphorus - Kali. PCR: Polymerase Chain Reaction. PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria.

ppm: parts per million. PSM: Phosphate Solubilizing Microorganisms.