Luận án: Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ thực vật miền Trung điều trị đái tháo đường type 2

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ XUÂN THU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 CỦA CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU HÁI TẠI MIỀN TRUNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ XUÂN THU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 CỦA CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU HÁI TẠI MIỀN TRUNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. ĐẶNG ĐỨC LONG 2. THÀNH THỊ THU THỦY ĐÀ NẴNG - 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định. Nguyễn Thị Xuân Thu ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này tôi xin được gửi lời biết ơn trân trọng nhất tới TS.Đặng Đức Long và PGS. Thành Thị Thu Thủy, người đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng xin cảm ơn đến các thầy cô, cán bộ nghiên cứu công tác tại bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa đã ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian hoàn thành luận án.

Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu tại Trung tâm Các phương pháp phổ ứng dụng – Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ đo phổ NMR, MS và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành bản luận án. Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án. Xin chân thành cảm ơn! iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC.iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT.

vi DANH MỤC CÁC BẢNG. ix DANH MỤC CÁC HÌNH. XI MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu của luận án. Nội dung nghiên cứu của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.

Bệnh đái tháo đường. Bệnh đái tháo đường. Bệnh sinh đái tháo đường type 2. Thuốc trong điều trị đái tháo đường.

Tổng quan về cây chè dây và lá đắng. Cây chè dây (Ampelosis cantoniensis (Hook. Giới thiệu về cây lá đắng (Vernonia amygdalina Del. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về thảo dược trong điều trị đái tháo đường.

Tình hình nghiên cứu về thảo dược trong điều trị ĐTĐ trên thế giới. Tình hình nghiên cứu về thảo dược trong điều trị ĐTĐ tại Việt Nam. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nguyên liệu thực vật.

Nguyên liệu động vật. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm. Thiết bị thí nghiệm. Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp chiết xuất. Phương pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 2. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 20 mẫu thực vật trên chuột nhắt ĐTĐ type 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết thực vật lên cấu trúc mô tụy và gan chuột ĐTĐ type 2.

Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao chiết phân đoạn mẫu lá chè dây, lá đắng trên chuột nhắt ĐTĐ type 2. Phương pháp khảo sát khả năng giảm hoạt tính enzyme α-glucosidase và α-amylase của các hợp chất phân lập. Phương pháp đánh giá hoạt động chống viêm và cải thiện tính kháng insulin của các hợp chất tinh sạch dựa trên dòng tế bào Raw 264. Chuẩn bị cao hỗn hợp các thảo dược có khả năng hạ đường huyết.

Xác định độc tính cấp của cao hỗn hợp. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Kết quả tách chiết mẫu. Kết quả gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 thực nghiệm. Gây chuột nhắt béo phì. Các chỉ số mỡ máu ở chuột nhắt béo phì.

Gây ĐTĐ type 2 trên chuột béo sau tiêm STZ. Định lượng insulin trong máu chuột nhắt sau khi tiêm STZ. Nghiệm pháp dung nạp glucose. Kết quả tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết thực vật trên chuột ĐTĐ type 2.

Sàng lọc đợt I. Sàng lọc đợt II. Sàng lọc đợt III. Sàng lọc đợt IV.

Kết quả nghiên cứu cao chiết chè dây và lá đắng. Ảnh hưởng của cao chiết chè dây và lá đắng lên kết quả mô bệnh học của tụy và gan. Nghiên cứu cao chiết phân đoạn lá chè dây. Nghiên cứu các cao chiết phân đoạn lá đắng.

Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng. Hoạt động chống viêm và cải thiện tính kháng insulin của các hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng. Thảo luận về cơ chế hạ đường huyết của các hợp chất phân lập từ cây chè dây và lá đắng. Kết quả cao hỗn hợp nguồn gốc từ thực vật có khả năng hạ đường huyết.

Phối hợp các cây thảo dược để tăng hiệu quả trong điều trị ĐTĐ. Hiệu quả hạ đường huyết của cao hỗn hợp. Hiệu quả của cao hỗn hợp ở các chỉ số mỡ máu trên chuột ĐTĐ. Hiệu quả cao hỗn hợp lên hàm lượng glycogen ở gan chuột ĐTĐ.

Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao hỗn hợp. Nghiên cứu độc tính cấp của cao hỗn hợp. 114 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 116 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ.

120 TÀI LIỆU THAM KHẢO. PL1 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT 1 H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR : 13 C-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon) Akt : Protein Kinase B ATP : Adenosine triphosphate CBuOH : Cao n-buthanol CC : Cao cồn CEtOAc : Cao ethylacetate CHe : Cao n-hexane COSY : Chemical Shift Correlation Spectroscopy COX-2 : cyclooxygenase 2 DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ĐTĐ : Đái tháo đường ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch liên kết với enzym) ERK : Extracellular signal-regulated kinase (tín hiệu ngoại bào điều tiết kinase) FFA : Free fatty acid (acid béo tự do) g : Gam GLP : Glucagon like peptide GLUT : Glucose transporter (yếu tố vận chuyển glucose) Grb2 : Growth factorreceptor-bound h : Giờ HFD : High fat diet (Chế độ ăn giàu chất béo) HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence vii IC50 : Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ gây ức chế 50% hoạt tính sinh học hoặc hóa sinh) IDF : International Diabetes Federation (Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế) IFG : Impaired fasting glucose (rối loạn đường huyết lúc đói) IGT : Impaired glucose tolerance (rối loạn dung nạp glucose) IKK-beta : IkappaB kinase beta IL-1β : Interleukin-1 beta, IL- 6 : Interleukin-6, IL-8 : Interleukin-8 iNOS : Nitric oxide synthase IR : Insulin receptor IRS : Insulin receptor substrate JNK : C-Jun NH2-terminal kinase LD50 : Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) LPS : Lipopolysaccharide m : Khối lượng MAPK : Mitogen activated protein kinase μg : Microgram μl : Microlit mg : Miligam ml : Mililit MS : Mass Spectroscopy (phổ khối lượng) ND : Normal diet (Ăn chế độ ăn bình thường) NFκB : Nuclear factor-кB NMR : Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) OD : Optical Density (Mật độ quang) P-value : Probability value (Trị số p) viii PDK1 : Phosphoinositide-Dependent Kinase 1 PDK2 : Phosphoinositide-Dependent Kinase 2 PGE2 : Prostaglandin E2 PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase PIP2 : phosphatidyl-Inositol-(4,5) biphosphate PIP3 : Phosphatidylinositol- (3,4,5) -triphosphate PPAR : Peroxisome proliferator activator receptor PPARγ : Peroxisome proliferator-activated receptor PTP1B : Protein tyrosine phosphatase 1B R : Receptor R2 : Hệ số tương quan Rf : Hệ số di chuyển ROS : Reactive oxygen species (các chuỗi phản ứng oxy hóa) SGLT1 : Sodium-glucose linked transporter STZ : Streptozocin TNF-α : yếu tố hoại tử khối u-alpha TV : Thực vật USD : Đô la Mỹ WHO : World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới ix DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang bảng 1. Phân loại bệnh ĐTĐ 6 1. Tổng quan bệnh ĐTĐ ở Việt Nam 9 1.

Một số thuốc và nhóm thuốc chống tăng đường huyết 15 1. Thảo dược trong điều trị đái tháo đường 25 Các hợp chất có khả năng chống viêm hoặc cải thiện tính 1. 30 kháng insulin Các dịch chiết và hợp chất chiết xuất từ thực vật ức chế 1. 36 α-amylase hoặc α-glucosidase Các loại thực vật (20 loài) được thu nhận tại miền Trung 2.

Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 48 Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột 2. Bố trí thí nghiệm gây chuột ĐTĐ type 2 53 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết 2. 57 của cao chiết phân đoạn chè dây và lá đắng 3. Kết quả tách chiết các mẫu thực vật 66 3.

Trọng lượng của chuột sau 8 tuần nuôi 67 Sự khác biệt về các chỉ số mỡ máu chuột ở nhóm ND và 3. 68 HFD Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá 3. 81 chè dây Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống 3. 82 cao chiết phân đoạn lá chè dây 3.

Các số liệu phổ của phloretin 87 x Số hiệu Tên bảng Trang bảng 3. Các số liệu phổ của myricitrin (CDE4) 89 Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá 3. 91 đắng Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống 3. 92 cao chiết phân đoạn lá đắng 3.

Các số liệu phổ của vernonioside E 96 Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các 3. 98 hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng Nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các 3. 110 cao chiết Nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các 3. 110 cao hỗn hợp Kết quả đánh giá số chuột chết ở các nhóm thử nghiệm sau 3.

115 khi uống cao hỗn hợp xi DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình Trang hình 1. Con đường truyền tin nội bào của insulin 11 1. Cơ chế phân tử của tính kháng insulin 13 1.