Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus PRRS HUA 01 & 02 tại miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Thị Lan 2. Phạm Công Hoạt NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Lê Thị Toan i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tôi: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Nguyễn Thị Lan và PGS. Phạm Công Hoạt người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy, cô mà luận án của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân trong gia đình và cơ quan đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Lê Thị Toan ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. viii Danh mục hình.

x Trích yếu luận án. xiii Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài.

Mục tiêu chung. Mục tiêu cụ thể. Phạm vi nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của đề tài. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài. Ý nghĩa khoa học của đề tài.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu. Tình hình về PRRS trên thế giới và Việt Nam. Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới.

Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam. Một số hiểu biết về virus PRRS. Cấu trúc virus PRRS. Phân loại virus PRRS.

Sức đề kháng của virus PRRS. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS. Một số hiểu biết về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS).

Truyền nhiễm học. Triệu chứng và bệnh tích. Chẩn đoán và phòng trị bệnh. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp nuôi cấy tế bào.

Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào. Phương pháp xác định TCID50. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus. Phương pháp RT-PCR.

Phương pháp giải trình tự gene. Phương pháp Realtime RT-PCR. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm. Phương pháp khám lâm sàng.

Phương pháp mổ khám. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý. Phương pháp hóa mô miễn dịch. Phương pháp ELISA.

Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm. Kết quả và thảo luận. Nghiên cứu đặc tính sinh học của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02.

Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. Kết quả nghiên cứu xác định sự ổn định của các đời virus qua các đời cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu xác định đường biểu diễn sự nhân lên của 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.

Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía bắc Việt Nam. Kết quả phản ứng RT-PCR. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Kết quả truy cập ngân hàng gene.

So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu. So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa các chủng virus nghiên cứu. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu. Kết luận và kiến nghị.

113 Danh mục công trình đã công bố. 114 Tài liệu tham khảo. 124 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) HE Haematoxylin-Eosin (Thuốc nhuộm tiêu bản bệnh lý) IHC Immuno Histochemistry (Hóa miễn dịch tổ chức) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào một lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhược độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ giữa số lượng virus và số lượng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) OD Optical Density (Mật độ quang) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở trong hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) RNA Ribonucleic acid (gen sợi đơn) vi RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) S/P Sample/Positive (giá trị tính toán trong phản ứng ELISA) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (Cơ chất bắt màu huỳnh quang) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2. Protein cấu trúc của PRRSV.

Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 và chủng virus vắc-xin. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 qua các đời cấy chuyển.

Hiệu giá 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 qua các đời cấy chuyển. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của lợn lô 1 trước khi gây nhiễm thực nghiệm bằng phương pháp ELISA. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của lợn lô 2 trước khi gây nhiễm thực nghiệm bằng phương pháp ELISA. Kết quả xét nghiệm sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng phương pháp RT-PCR.

Kết quả xét nghiệm PRRSV bằng phương pháp RT-PCR. Kết quả xét nghiệm hàm lượng PRRSV bằng phương pháp Realtime RT-PCR. Bảng tổng hợp triệu chứng lâm sàng chủ yếu của các lợn được gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02.

Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (tiếp). Bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. Kết quả xác định virus PRRS ở lợn gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp hóa mô miễn dịch. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu.

Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu.

Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu. Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu. Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu. 106 ix DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.

Hình thái virus PRRS. Hình ảnh cấu trúc hệ gene của virus PRRS. Kết quả quy luật sinh trưởng của virus PRRS trên môi trường nuôi cấy Marc 145. Quy luật nhân lên của virus trên các môi trường nuôi cấy dòng tế bào BHK-21, Marc 145, 3D4/31.

Quan hệ về nguồn gốc di truyền của virus PRRS với các virus khác trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae. Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào. Gây nhiễm virus bằng cách nhỏ niêm mạc mũi .