Nghiên cứu tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155.21 – Luận văn Thạc sĩ Dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BO Y TE TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI PHAM HUY BACH NGHIEN CUU SINH TONG HOP KHANG SINH TU STREPTOMYCES 155.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM HUY BÁCH NGHIÊN CỨU SINH TỎNG HỢP KHÁNG SINH TU STREPTOMYCES 155.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHÉ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Cao Văn Thu HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo PGS. Cao Văn Thu - người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên từ lúc chuân bị đề cương nghiên cứu cho đến khi tôi hoàn thiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn VI sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược, Trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Phòng phân tích phô - Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm.

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, luận văn này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2015 Học viên PHẠM HUY BÁCH MỤC LỤC DAT VAN DE wececsccsecscsssssessssussussucsvcsecsesarsussassussucsucsucsesessatsussussussussucsesiesarsassasaueaecaeearears 1 Churong I. TONG QUAN ooesssecsssesssessssssesssesssesssecssscssscssscssessuscsscssesssesssesssecssessnesssesssecase 2 1. Dai cong vé khang sinh. Ứng dụng của chất kháng sinh.

Đại cương về xạ khuẩn.--- 2: se se keEkEE9E157112112111111111111. Một số đặc điỂm. Các yếu tổ ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh. Đặc điểm xạ khuân chỉ StreptomyCes.

Phân loại chi StrepfOmyC€S. ¿1 kh TT HH TH HH TH ri, 10 1. Đặc điểm xạ khuẩn Streptomyces 155. Cải tạo giống và lên men.----2¿2+©+++2+++EE+++EEE+EEEESEEEEEEEEEExrrrkrrrrrrrrrree 11 L.

Cai ta0 SiO. Lên men sinh tổng hợp KS. Chiết tách, tỉnh chế. crrke 14 neo in.

Tách và tinh chế 1. Nghiên cứu cấu trúc KS bằng đo phổ. Phổ hồng ngoại. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

Phân loại, xác dinh tén xa khuan bang k¥ thudt gen. Một số nghiên cứu mới về tông hợp kháng sinh từ chủng S/repfomyces. Kỹ thuật tăng sinh tổng hợp toyocamycin từ Streptomyces diastatochromogenes 128. -- -¿- ¿+ k1 TT HT TH TH nhàn 19 1.

Kháng sinh kháng nắm dòng Actinomycin-D do Streptomyces sp. IA1 phân lập từ đất vùng Saharan.----¿-22:©22++222xt22ExC221EE221E221E111111. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.----:+¿©+++2+++2E+++EEE+EEEES2EESEEEEEExEEExrtrkkrrrrrerrree 21 2.

Chủng xạ khuân nghiên cứu. Vi sinh vật kiểm định.--- -- 2s Sk E SE EE21121111121111. Môi trường nghiên CỨU.-- -- + 11T TH HT TH TT HT HH Hit 21 2. Môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu.

Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định. Thuốc thử, dung môi, hoá chắt. Phương tiện và máy móc. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp nuôi cấy và giữ giống. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán23 2. Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên. Phương pháp đột biến.

Phương pháp lên men mẻ. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ. Phương pháp phân lập các hợp chất. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết các hợp chất phân lập được.

Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU.-- 2252222 2EESEE2EEE2EEE2EEE2EEE. Nghién cru cai ta0 SiG. Kết quả sàng lọc ngẫu niet.

Kết quả đột biến lần 1. Kết quả đột biến lần 2. Nghiên cứu chọn chủng lên men mẻ phù hợp. Chiết tách, phân lập kháng sinh sinh tổng hợp được.

Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường đến quá trình chiết xuất. Kết quả tách bằng phương pháp sắc ký cột. Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập được. Sơ bộ biện giải hợp chất phân lập được.

Nghiên cứu cải tạo giống của chủng Šfreptomyces 155. Nghiên cứu môi trường lên men chìm. Chiết xuất, tinh chế và biện giải phổ kháng sinh phân lập được. 48 KET LUAN VA KIEN NGHHỊ,.-- 2 - + +S+SE+EE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEX11121111.

52 AND ARN ATCC DM ĐB IR ISP KS MT NMR SLNN SKLM (TLC) STH UV VK VSV Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt Acid Deoxyribonucleic Acid ribonucleic American Type Culture Collection (Trung tâm lưu giữ chủng Hoa Kỳ) Dung môi Đột biến Infrared (hồng ngoại) International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces Quốc tế) Kháng sinh Môi trường Nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) Sàng lọc ngẫu nhiên Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromography) Sinh tổng hợp Ultra violet (tử ngoại) Vi khuẩn Vi sinh vật Danh muc cac bang, biéu Bang Trang Bảng 2. Các môi trường nuôi cây xạ khuân 21 Bảng 2. Môi trường nuôi cây vi sinh vật kiêm định 22 Bang 3. Ket qua sang loc tu nhién chung Streptomyces 155.

Kêt quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biên lân 1 31 Bảng 3. Kêt quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biên lân 2 33 Bảng 3. Kêt quả lên men các dạng chủng, biên chủng tôt nhât ở môi trường MT2dd 35 Bảng 3. Kêt quả thử ảnh hưởng pH đên khả năng chiết kháng sinh 38 Bảng 3.

Kết quả biện giải một số đỉnh carbon của khung 2-amino-1,4,6,9- 46 tetramethyl-3H-phenoxazin-3-one trong chat KS2 Bảng 3. Nông độ ức chế tôi thiêu của Actinomycin X2 trên một số vi khuân 50 Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình Trang Hình 1. Một số câu trúc kháng sinh thường dùng hiện nay 3 Hình 3. Biêu đô thê hiện hoạt tính kháng khuân của các dạng chủng khi chọn 30 lọc ngẫu nhiên Hình 3.

Biêu đồ thê hiện sự thay đôi hoạt tính kháng khuẩn trên B. mirabilis sau đột biến lan 1 Hình 3. Biêu đồ thê hiện sự thay đôi hoạt tính kháng khuân trên B. mirabilis sau đột biến lẫn 2 Hình 3.

Hình ảnh vòng vô khuẩn của các dạng chủng, biến chung trén B. mirabilis khi én men chim Hình 3. Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuân các dạng chủng, biến chủng| 37 trén B. mirabilis khi én men chim Hình 3.

Kết quả hiệu suất tách kháng sinh khi sử dụng pH khác nhau với dung| 38 môi etyl acetat Hình 3. Sơ đồ phân lập các kháng sinh sinh tông hop dugc ttr Streptomyces 39 155. Sac ky do TLC phân đoạn FR2 và các chât kháng sinh phân lập được 40 Hình 3. Hình ảnh sắc ký do sac ky lop mong xac dinh d6 tinh khiét chat KS1 41 và KS2 (quét lớp mỏng ở bước sóng UV 440 nm sau khi phun thuốc thử) Hình 3.

Sắc ký đồ HPLC định tính các hợp chất phân lập được trong mẫu 42 kháng sinh tổng thu được (bước sóng 443 nm) Hình 3. Sắc ký đô HPLC xác định độ tính khiết chât KSI (bước sóng phát 43 hiện 443 nm) Hình 3. Sắc ký đô HPLC xác định d6 tinh khiét chat KS2 (budc song phát 43 hiện 442 nm) Hình 3. Hình ảnh phô UV của chat Actinomycin D, chat KS2 và khung 2- 45 amino- ],4,6,9-tetramethyl-3H-phenoxazin-3-one Hình 3.

Công thức câu tạo của Actinomycin D 46 DAT VAN DE Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật của nước ta ngảy cảng đa dạng thì vai trò của kháng sinh trong điều trị ngày càng được nâng cao. Kháng sinh là nhóm hoạt chất có tác dụng sinh học rất mạnh, được tổng hợp hay bán tổng hợp từ vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nắm hoặc từ một số thực vật bậc cao [1], [6]. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng kháng sinh đạt được những thành tựu rực rỡ. Con người không chỉ tìm kiếm những chủng vi sinh vật sinh kháng sinh từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền, công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp [1].

Cho đến nay đã phát hiện được khoảng 17.000 chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật và khoảng 60.000 chất kháng sinh bán tổng hợp, nhưng chỉ có 1-2% (khoảng 600-1200 chất kháng sinh) có đủ tiêu chuẩn ứng dụng trong y học [1], [6], [7]. Và trong số đó khoảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra, trong đó chủ yếu do chi Streptomyces sản xuất. Đây là chỉ xạ khuẩn lớn, gồm nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, một số loài có khả năng sinh tổng hợp các kháng sinh chữa nhiễm trùng khuẩn Gr(-), ung thư. Do đó, chỉ xạ khuẩn này đang được nước ta tập trung nghiên cứu.

Qua những nghiên cứu ban đầu cho thay ching Streptomyces 155.21 do b6 mén Vi sinh - Sinh học cung cấp có hoạt tính kháng sinh mạnh và ôn định, phổ rộng va có nhiều tiềm năng trong thực tế [2], [9] nên chúng tôi chọn dé tai: "Nghiên cứu sinh tổng hợp khang sinh ttr Streptomyces 155.21” với các mục tiêu: 1. Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh của chung Streptomyces 155. Chiết tách, phân lập một số hoạt chất chính của chủng S/reptomyces 155. Đại cương về kháng sinh 1.

Định nghĩa Vuillemin (1889) đã đề cập đến từ chất kháng sinh - “antibiosis” với ý nghĩa là sự kháng giữa các sinh vật sống để bảo vệ cho bản thân vật chủ [§], [33]. Sau đó năm 1942, Waksam định nghĩa chất kháng sinh - “antibiotics” là những chất được tạo ra bởi các vi sinh vật, nó chống lại sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật 34]. Xét về mặt từ ngit, “antibiotics” có nghĩa là kháng sinh (anta = khang, bios = sw sống) — có ý nghĩa quá rộng, bao gồm cả các thuốc sát tring nhu EtOH, pivodon,. ma lại không nêu được tính chuyên biệt trên vi sinh vật gây bệnh, độc tính thấp ở mức liều điều trị [14], [341.

Theo định nghĩa mới nhất: Kháng sinh là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các VSV (cũng như cả các té bao ung thư) ở nồng độ thấp [6]. Phân loại Có nhiều cách phân loại KS: như phân loại theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học. Trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được xem là khoa học và thông dụng nhất [6].