Nghiên cứu tạo cây đậu xanh kháng mọt - Luận án của Hoàng Thị Thao

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của GS. Chu Hoàng Mậu và PGS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trong các tạp chí khoa học công nghệ, phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 03 năm 2017 Tác giả luận án Hoàng Thị Thao ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. Chu Hoàng Mậu, PGS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hƣớng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. Lê Văn Sơn và các cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành các thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Nông - Lâm Bắc Giang, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác. Tôi rất biết ơn những ngƣời thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày tháng 03 năm 2017 TÁC GIẢ Hoàng Thị Thao iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC.

iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .v DANH MỤC CÁC BẢNG. vii DANH MỤC CÁC HÌNH. viii MỞ ĐẦU. Mục tiêu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

ĐẶC ĐIỂM CỦA MỌT HẠI ĐẬU XANH VÀ SỰ THIỆT HẠI DO MỌT GÂY RA CHO ĐẬU XANH. Cây đậu xanh. Mọt đậu xanh và ảnh hƣởng của mọt đến bảo quản hạt đậu xanh. Đánh giá khả năng kháng mọt của đậu xanh.

DEFENSIN THỰC VẬT. Các nhóm defensin thực vật. Cấu trúc của defensin thực vật. Hoạt động ức chế của defensin thực vật.

Một số nghiên cứu biểu hiện gen defensin thực vật. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN DEFENSIN THỰC VẬT Ở MỘT SỐ LOÀI ĐẬU THUỘC CHI VIGNA. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở một số loài đậu thuộc chi Vigna. Hệ thống tái sinh in vitro và tạo cây đậu xanh chuyển gen.

Một số thành tựu chuyển gen defensin ở thực vật. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. Vật liệu thực vật.

Các chủng vi khuẩn và các loại vector. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. Các loại thiết bị máy móc. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu. Phƣơng pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide. Thiết kế vector chuyển gen.

Phƣơng pháp tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn A. Nhóm phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen. Các phƣơng pháp phân tích, xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1 CỦA CÂY ĐẬU XANH. Khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu. Khuếch đại và tách dòng gen VrPDF1 t giống đậu xanh T m TH và ĐX22. Đặc điểm của gen VrPDF1 phân lập t hai giống đậu xanh T m TH và ĐX22.

Thảo luận về cấu trúc của protein defensin. Sự đa dạng về trình tự nucleotide trong vùng mã hoá của gen VrPDF1 ở cây đậu xanh. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VrPDF1 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT ĐỘNG CỦA VECTOR CHUYỂN GEN TRÊN CÂY THUỐC LÁ. Thiết kế vector biểu hiện ở hạt thực vật mang gen VrPDF1 b ng kỹ thuật Gateway.

Tạo cây thuốc lá chuyển gen in vitro mang gen VrPDF1. Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen b ng kỹ thuật PCR và Southern blot. Phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1. TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VrPDF1 Ở GIỐNG ĐẬU XANH ĐX22.

Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển VrPDF1 trong hệ gen cây đậu xanh chuyển gen. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển VrPDF1 trong các dòng cây đậu xanh chuyển gen T1. Kiểm tra hoạt động ức chế -amylase t ấu trùng mọt của protein tái tổ hợp rVrPDF1 ở thế hệ T1.

Thảo luận kết quả tăng cƣờng biểu hiện protein VrPDF1 ở cây đậu xanh chuyển gen. 95 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 100 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .101 TÀI LIỆU THAM KHẢO .102 v DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT µg Microgam AS Acetylseringone BAP Benzylaminopurine bp Base pair Cặp bazơ nitơ cs Cộng sự CCM Cocultivation medium Môi trƣờng đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA DNA bổ sung Hexadecyltrimethyl ammonium CTAB bromide Cys Cysteine DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Enzyme-linked immunosorbent Xét nghiệm ELISA ELISA assay GM Germination Medium Môi trƣờng nảy mầm Gus β-Glucuronidase HRP Horseradish Peroxidase IAA Indole Acetic acid Isopropyl β-D-1- IPTG thiogalactopyranoside Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige và Skoog, 1962 Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản nuôi cấy mô thực vật vi mRNA Messenger ribonucleic acid NAA Naphthaleneacetic acid NptII Neomycyn phosphatranferaseII Gen kháng kanamycine OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PDF1 Plant defensin type 1 Gen defensin 1 ở đậu xanh RNA Ribonucleic acid RM Rooting medium Môi trƣờng tạo rễ RT-PCR Reverse transcription polymerase Phản ứng chuỗi polymerase phiên chain reaction mã ngƣợc rVrPDF1 Recombinant VrPDF1 protein Protein defensin tái tổ hợp VrPDF1 ScFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Shoot Elongation Medium Môi trƣờng kéo dài chồi SIM Shoot Induction Medium Môi trƣờng tạo đa chồi TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase Đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực T-DNA Transfer DNA vật Ti-plasmid Tumor inducing – plasmid Plasmid gây khối u T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen Cây chuyển gen tái sinh t chồi T0 trong ống nghiệm Hạt của cây chuyển gen T0 nảy T1 mầm thành cây T1 TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine v/p Vòng /phút WT Wild type Kiểu dại X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galacto-pyranoside vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.

Một số thực vật chuyển gen defensin. Nguồn gốc các giống đậu xanh nghiên cứu. Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong nghiên cứu. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA.

Các thành phần bổ sung phản ứng tổng hợp cDNA. Thành phần phản ứng PCR nhân gen VrPDF1. Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen VrPDF1. Thành phần phản ứng ghép nối gen VrPDF1 vào vector tách dòng pBT.

Thành phần phản ứng ghép nối gen VrPDF1 với vector pDON201- SLHEP-HA. Thành phần phản ứng LR. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy in vitro cây đậu xanh. Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh qua các thời gian nhiễm mọt.

Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của gen VrPDF1. Các vị trí amino acid sai khác giữa ba trình tự amino acid suy diễn của gen VrPDF1. Thống kê một số trình tự gen PDF1 sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền. Hệ số tƣơng đồng và hệ số phân ly của các giống đậu xanh dựa trên trình tự nucleotide của gen VrPDF1.

Hệ số tƣơng đồng và hệ số phân ly của các giống đậu xanh dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen VrPDF1. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso -VrPDF1 vào mô lá thuốc lá. Hoạt độ của -amylase t ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ với dịch chiết protein t hạt của các dòng cây thuốc lá chuyển gen và t hạt cây không chuyển gen. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22.

Hoạt độ của -amylase t ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ với dịch chiết protein t hạt của các dòng đậu xanh chuyển gen T1 và t hạt cây không chuyển gen. 93 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. Sơ đồ cấu trúc tiền protein của hai lớp defensin thực vật. Cấu trúc không gian của protein defensin ở động vật, côn trùng và thực vật.

Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2). Mô hình cấu trúc defensin VrD1 ở cây đậu xanh. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang gen kháng mọt VrPDF1.

Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen ở cây đậu xanh. Biểu đồ so sánh khối lƣợng hao hụt giữa các giống đậu xanh sau các thời điểm nhiễm mọt. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 của hai giống đậu xanh T m TH và ĐX22. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân gen VrPDF1 t các dòng khuẩn lạc E.

Trình tự nucleotide gen VrPDF1 (cDNA) của hai giống đậu xanh T m TH, ĐX22 và trình tự mang mã số AB020613 trên GenBank. Trình tự amino acid suy diễn t gen VrPDF1 của hai giống đậu xanh T m TH, ĐX22 và đoạn trình tự mang mã số AB020613. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen VrPDF1 phân lập t mRNA và DNA của giống đậu xanh T m TH và ĐX22. Sơ đồ các cầu nối disulfide giữa các cặp Cys trong vùng chức năng của protein VrPDF1.

Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide của gen VrPDF1 của các giống đậu xanh. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự amino acid của gen VrPDF1.