Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen DAT tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn - Bùi Thị Hà, Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L. Don ) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L. Don ) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Thị Tâm 2.

Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. Nguyễn Thị Tâm và GS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các tạp chí khoa học công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Bùi Thị Hà ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. Chu Hoàng Mậu và PGS. Nguyễn Thị Tâm đã chỉ bảo, động viên và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có nhiều góp ý sâu sắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô và các cán bộ phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này. Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Y Dược, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Khoa học cơ bản, Trường Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và công tác.

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 12 năm 2017 TÁC GIẢ Bùi Thị Hà iii MỤC LỤC Lời cam đoan…………………………………………………. ii Mục lục……………………………………………………….………… iii Danh mục những chữ viết tắt trong luận án……………………………. vi Danh mục bảng trong luận án…………………………………………… ix Danh mục hình trong luận án…………………………………………… xi MỞ ĐẦU………………………………………………….

Mục tiêu nghiên cứu…………………………………………………. Nôi dung nghiên cứu………………………………………………. Những đóng góp mới của luận án………………………………. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án…………………….

TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………….Alkaloid ở cây dừa cạn…………………………………. Vai trò của alkaloid thực vật. Alkaloid ở cây dừa cạn…………………………………………. Sinh tổng hợp alkaloid và hoạt động của enzyme DAT ở cây dừa cạn.

Quá trình sinh tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn…………. Hoạt động của enzyme DAT và gen DAT. Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn. Định hướng nghiên cứu nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa iv cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật…………………… 18 1.

Nâng cao hàm lượng vinblastine và vincristine bằng kỹ thuật chuyển gen………………………………………………………………. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 26 2. Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu thực vật………………………………………………….

Chủng vi khuẩn và các loại vector………………………………. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu………………………. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu…………………………………… 26 2. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án…………………….

Phương pháp nghiên cứu…………………………………………. Các phương pháp sinh học phân tử……………………………… 28 2. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 32 2. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá.

Tái sinh và chuyển gen gus ở cây dừa cạn. Chuyển gen CrDAT vào cây dừa cạn thông qua A. Phương pháp phân tích cây chuyển gen. Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen………………………… 46 2.

Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu……………………… 47 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………. Đặc điểm của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn. Kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen v CrDAT………………………………………………………………………….

So sánh trình tự nucleotite của gen CrDAT. Thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá 55 3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT……. Phân tích biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen.

Thảo luận kết quả thiết kế và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen pBI121-CrDAT………………………………………………… 66 3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn. Nuôi cấy in vitro cây dừa cạn…………………………………… 69 3. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen gus……………….

Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn. Kết quả chuyển gen CrDAT và tạo cây dừa cạn chuyển gen. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT và tái sinh cây dừa cạn chuyên gen. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ gen của các cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T0.

Phân tích biểu hiện protein DAT tái tổ hợp ở thế hệ T1. Thảo luận về kết quả sự tăng cường biểu hiện gen CrDAT ở cây dừa cạn chuyển gen…………………………………………………… 95 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………. 99 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIỆN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN…. 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 101 PHỤ LỤC…………………………………………………………….

118 vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AS Acetosyringone A. Tumefaciens Agrobacterium tumefaciens A. Rhizogenes Agrobacterium rhizogenes BAP Benzylaminopurine 35S Promoter CaMV 35S bp base pair Cặp bazơ nitơ cs cộng sự CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary DNA DNA bổ sung Cetyltrimethyl ammonium CTAB Bromide Deacetyl vindoline 4-O- Gen DAT DAT acetyltransferase DEPC Diethyl pyrocarbonate dNTP Deoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli Ethylene diamine tetraacetic EDTA acid Enzyme-linked immunosorbent Phản ứng ELISA ELISA assay GM Germination Medium Môi trường tái sinh gus β-Glucuronidase IAA Indole Acetic acid Isopropyl β-D-1- IPTG thiogalactopyranoside vii Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige và Skoog Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô thực vật mRNA Messenger ribonucleic acid NAA Naphthaleneacetic acid NptII Neomycyn phosphatranferaseII Gen kháng kanamycine OD Optical density Mật độ quang Phản ứng chuỗi PCR Polymerase chain reaction polymerase RNA Ribonucleic acid RM Rooting medium Môi trường tạo rễ rCrDAT Recombinant CrDAT protein Protein DAT tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulfate SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase Đoạn DNA được chuyển T-DNA Transfer DNA vào thực vật T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen Cây chuyển gen tái sinh từ T0 chồi trong ống nghiệm Hạt của cây chuyển gen T0 T1 nảy mầm thành cây T1 viii TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine WT Wild type Cây không chuyển gen X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-galacto-pyranoside 1 MỞ ĐẦU 1.

Đặt vấn đề Hiện nay, loài người trên thế giới đang phải đối mặt với rất nhiều căn bệnh nguy hiểm: ung thư, AIDS, tiểu đường, thoái hóa khớp, viêm gan B, C. Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tỉ lệ người mắc ung thư năm 2012 là 14 triệu người, đến năm 2015 đã có hơn 90 triệu người mắc ung thư và hàng năm có hơn 8 triệu người chết vì ung thư [42]. Bệnh ung thư đang gia tăng ở trẻ em.

Tại Mỹ, năm 2016 có hơn 10 nghìn trẻ mắc ung thư từ sơ sinh đến 14 tuổi và có khoảng hơn một nghìn trẻ sẽ chết vì căn bệnh này [44]. Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển thuốc chữa các bệnh ung thư là vấn đề cấp bách hiện nay. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L. Don) là một trong những loại cây dược liệu quý.

Cây dừa cạn có khả năng sản xuất các indole alkaloid có dược tính quan trọng và ứng dụng trong sản xuất các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là ung thư máu. Ngoài ra, cây dừa cạn còn được chỉ dẫn trong điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp và một số bệnh ung thư khác. Trong dân gian, dừa cạn được sử dụng trị cao huyết áp, bệnh tiểu đường, điều hòa kinh nguyệt, chữa tiêu hóa kém và chữa lị, lợi tiểu khá mạnh, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, tẩy giun, chữa sốt cao [12]. Trong tất cả các alkaloid thực vật, terpenoid indole alkaloid (TIA) là một nhóm quan trọng chứa hơn 3000 loại hợp chất có cấu trúc đa dạng và được tìm thấy ở 8 họ thực vật [120].

Trong đó, các loài cây có nguồn gốc từ họ mã tiền (Loganiaceae), họ trúc đào (Apocynaceae) và họ cà phê (Rubiaceae) chứa hàm lượng alkaloid cao [40]. Dừa cạn có chứa 2 loại alkaloid là vinblastine và vincristine được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh ung thư [107]. Vinblastine và vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân chia tế bào và do vậy ngăn cản sự tăng số lượng tế bào. Ngoài ra, một số TIA khác như ajmalicine và serpentine 2 được sử dụng để điều trị rối loạn tuần hoàn [107].

Quá trình chuyển hóa tổng hợp các TIA ở cây dừa cạn là một quá trình phức tạp, trải qua nhiều phản ứng với sự tham gia của nhiều enzyme, các chất điều hòa và các chất vận chuyển [119]. Hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn hoang dại rất thấp [77]. Vì vậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật hiện đại, trong đó xác định và tăng cường biểu hiện enzyme chìa khóa là khâu nghiên cứu rất quan trọng. Deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn.

Biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme DAT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng vinblastine và vincristine trong dừa cạn được nâng cao. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm và biểu hiện được gen mã hóa deacetylvindoline-4-O- acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ cây dừa cạn. Tạo được cây dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid được cải thiện.

Nội dung nghiên cứu 3.