Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn streptomyces 15 2 9

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ũ ũ QUÁCH THỊ LÊ HÀ NGHIỀN CỨU SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES 15.9 (KHÓA LUẬN TỐT NGHỆP DUỢC s ĩ KHÓA 1999 - 2004) Giáo viên hướng dẫn: TS. Cao Văn Thu Nơi thực hiện : Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện : 15/10/2003 -15/05/2004 HÀ NỘI, 05-2004 m vưí-ĩti-L-H LỜI CẢM ƠN (ịỉ&ỉ lò tỉ (Ị lỉ/it/i ỉrott tỊ tùi bỉêí rít! iâ u iắe là l dein ehân. thành eủtn ổn th ỉnỊ íjiúfì : Qi£ <ĨMềt £7/tu Qiqttòi đã dành nhiều Ihềi ụlan, eỗnụ. tận tình ehi l)ảfí từt (ỊỈÚỊì đõ' iÂỈ trOítíỊ Ì U Ể Í quá.

trình tlttie hiền. Uiitứt luận tó/ mjíiìêp. í Mítâu i/ỉp II<11/ lời dein, ạửi lềi eâtn ổn. tói (títe ihàịỊ ííô tịiáo, Uịị thuật tùêtt Oĩồ tuồn.

phũtụ/ ban. trümj ^ỉrtiỉimỊ (£)ai UC)Ọe ■t)tiổe '3f)ỀL xjfatt’ tìiêti 3£h.ơ€L ^7ỗọe 3Cụ, CJhuät eùtiự bạn bè từi ạÙL đinh (Tã (Ịttíp itõ', ta& điều kiên. thuẠn Iđi chíì tỗi tr&ttự m ốt thài tịian họe tập lại trtíÝUiỊỊ eũ m ị nhu' th itc h iên lú iố a luân. ehăn thành, (iảni tín.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2004 Sinh, Iiìêỉi Quách Thị Lê Hà MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN Đ Ể. Vài nét về kháng sinh. Các ứng dụng của kháng sinh. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp một kháng sinh.

Đặc điểm của xạ khuẩn (Actinomycetes). Đặc điểm chung. Phân loại Streptomyces. Tuyển chọn và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh.

Phân lập giống xạ khuẩn. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên. Đột biến cải tạo giống. Bảo quản giôhg xạ khuẩn.

Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi sinh yật. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. Bản chất của quá trình lên m e n. Các phương pháp lên m en.

Tách và thu nhận các sản phẩm của quá trình lên m en. Các phương pháp chiết tách. Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong một số nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh gần đây. Nghiên cứu tiểu phẩn 20- kDa của enzym 2- Deoxy- scyllo- inosose (DOI) synthase.

Nghiên cứu lên men Streptomyces ỉividans biến đổi gen sản xuất quy mô lớn tác nhân hoại tử khối u chuột a (m T N F a). Dùng sinh khối v s v để thu hồi ion Zn2+. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.1 Giống xạ khuẩn.2 Chủng vi khuẩn kiểm định. Môi trường.

Dụng cụ và hoá chất. Phương pháp thực nghiệm. Phương pháp giữ giống. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuy ếch tán.

Phương pháp cải tạo giống vi sinh vật. Phương pháp xác định các môi trường nuôi cấy thích hợp. Phương pháp lên men gián đoạn. Phương pháp xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men.

Chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ. Tách kháng sinh bằng phương pháp trao đổi ion. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào. Tách kháng sinh bằng phương pháp sắc ký.

Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP. Kết quả thực nghiệm và nhận x é t. Phổ tác dụng của kháng sinh do Streptomyces15.9 sinh tổng hợp. Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp.

Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên giống xạ khuẩn. Kết quả đột biến cải tạo giống. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh. Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh.

Độ ổn định của dịch lọc theo thời gian. Kết quả chiết xuất và tinh chế. Kết quả thử kháng sinh nội bào. Hình thái và phân loại xạkhuẩn Streptomyces 15.

Bàn lu ận. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT.40 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleic AET: Anionic Enzym Tension active Be: Bacillus cereus ATCC 9946 Bp: Bacillus pumilus ATCC 6633 Bs: Bacillus subtilis ATCC 6633 D(mm): Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn tính theo milimet Ec: Escherichia coli ATCC 25922 ISP: (The International Streptomyces Project) Chương trình Streptomyces quốc tế MT: Môi trường mTNFa: (Murine Tumor Necrosis Factor a) Tác nhân a hoại tử khối u chuột PCR: The Polymerase Chain Reaction Pseu: Pseudomonas aeruginosa VM 201 Pro: Proteus mirabiỉis BV 108 s: Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh fSãh/Salmonella O\. typhi DT 220 Shi: Shigella flexneri DT 112 SI: Sarcina lutea ATCC 9341 Sta: Staphylococcus aureus ATCC 1228 V: Thể tích VSV: Vi sinh vật ĐẶT VÂN ĐỂ Trên thị trường Dược phẩm Việt Nam, gần như 100% thuốc kháng sinh được nhập ngoại dưới dạng nguyên liệu, bán thành phẩm hoặc thành phẩm. Nhu cầu sử dụng kháng sinh hiện nay rất lớn vì vậy chúng ta không thể để ngỏ thị trường này cho các hãng dược phẩm nước ngoài.

Muốn thế cần có sự đầu tư nghiên cứu sản xuất kháng sinh mà trước hết là ở quy mô phòng thí nghiệm. Vi sinh học hiện đại phát triển mạnh mẽ vào cuối thế kỷ XIX, đầu thế kỷ XX. Việc phát hiện ra penicillin của Alexander Fleming năm 1928 được coi là khởi đầu cho kỷ nguyên kháng sinh. Ngày nay cùng với sự phát triển của các ngành khoa học khác, ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh được đẩy mạnh.

Ngày càng có nhiều kháng sinh được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp hay bán tổng hợp nhưng con người vẫn không quên tìm kiếm các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên. Trong hơn 8000 kháng sinh được biết hiện nay thì 60% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 80% số đó là thuộc chi Streptomyces. Nước ta có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm tạo nên một hệ vi sinh vật phong phú, trong đó có các xạ khuẩn chi Streptomyces sinh kháng sinh đã và đang được nghiên cứu. Chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.9 được Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường đại học Dược Hà Nội phân lập từ đất bùn ao Vĩnh Bảo Hải Phòng có hoạt tính kháng sinh phổ rộng và tương đối ổn định, có tiềm năng ứng dụng trong thực tế.

Bởi vậy chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sình từ xạ khuẩn Streptomyces 15.9” cho khoá luận tốt nghiệp, với các mục tiêu: - Nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Sơ bộ nghiên cứu chiết tách kháng sinh và một vài tính chất của kháng sinh đã được sinh tổng hợp. - Phân loại Streptomyces 15. 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.VÀI NÉT VỂ KHÁNG SINH 1.1 Định nghĩa [1], [2], [5], [7],[8] ,[9] Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp, hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vsv xác định hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.

Các ứng dụng của kháng sinh [5], [9] Hầu hết các kháng sinh sản xuất là để chống lại vi khuẩn nhưng một số kháng sinh có những ứng dụng khác: chống ung thư, chống nấm, điều trị bệnh trên thực vật, bảo quản thực phẩm, trong hoá sinh và sinh học phân tử. Các ứng dụng rộng rãi này làm cho kháng sinh ngày càng có giá trị thương mại lớn nhưng đồng thời cũng thúc đẩy tỉ lệ kháng kháng sinh tăng cao. Cần phải kiểm soát việc sử dụng kháng sinh và cải thiện những kháng sinh sẵn có để tăng hoạt tính kháng sinh, giảm độc tính, giảm tác dụng phụ, mở rộng phổ, tác dụng chọn lọc với các tác nhân gây bệnh và hoàn thiện các đặc tính dược lý. Những cải tiến này có thể thu được bằng phương pháp hoá học hoặc sinh học (thay đổi quá trình tổng hợp, kỹ thuật tái tổ hợp.

Tuy nhiên những kháng sinh có cấu trúc hoàn toàn mới chỉ có thể hi vọng tìm được từ việc sàng lọc, đặc biệt là sử dụng quá trình thử nghiệm mới và nghiên cứu trên những nhóm vi sinh vật mới. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp một kháng sinh [5], [9] Hình 1 giới thiệu sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp một kháng sinh. 2 Hình 1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 1. ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN (ACTINOMYCETES) 1.

Đặc điểm chung [2], [7], [8], [17] Xạ khuẩn là vi khuẩn thật (Eubacteria), đa số thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) hiếu khí, sống hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi (khuẩn ty) phân nhánh, phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Sơ đồ phân loại xạ khuẩn: Actinomycetales Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae Micromonosporaceae Streptomyces. Nocardia Hình 2 : Sơ đồ vị trí phân loại của chi Streptomyces 1. Phân loại Streptomyces [3], [17] Có nhiều khoá phân loại Streptomyces khác nhau.

Tại hội nghị vi sinh thế giới lần X (tổ chức tại Mexico vào năm 1970), khoá phân loại của Shilling và Gottlieb được chọn làm khoá phân loại chính để phân loại chi Streptomyces và đặt tên là ISP ( The International Streptomyces Project). Khoá phân loại ISP dựa trên các đặc điểm: - Màu khuẩn ty khí sinh, màu khuẩn ty cơ chất, - Hình dạng chuỗi bào tử, 4 - Bề mặt, hình dạng, kích thước bào tử, - Khả năng tạo sắc tố melanoid, - Khả năng tạo sắc tố hoà tan, - Khả năng tiêu thụ nguồn cacbonhydrat. TUYỂN CHỌN VÀ BẢO QUẢN GIỐNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH [4], [5], [6], [7], [8], [9] 1. Phân lập giống xạ khuẩn Để phân lập xạ khuẩn sinh kháng sinh người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, bùn, nước cống.Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những xạ khuẩn sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng các phương pháp đặc trưng và trên các MT chọn lọc.

Các phương pháp phân lập giống xạ khuẩn: phương pháp cấy dịch chiết lên bề mặt thạch, phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn v s v kiểm định, phương pháp làm giàu đất, phương pháp thêm kháng sinh vào MT phân lập, phân lập vsv sinh kháng sinh chống ung thư. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên Các v s v có sự biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, tạo ra các biến chủng khác nhau, trong đó có biến chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 10%- 20% những biến chủng khác. Cần phải chọn lấy các biến chủng có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp. Đột biến cải tạo giống Các chủng mới phân lập gọi là các chủng nguyên thuỷ hay chủng hoang dại.

Các chủng này kể cả sau chọn lọc ngẫu nhiên đều không có khả năng siêu 5 tổng hợp. Để khắc phục hạn chế này các phương pháp đột biến đã được áp dụng. Những tác nhân đột biến chia 3 nhóm: - Hoá học: etylenimin, nitrit, hyđroxylamin. -Vật lý: ánh sáng tử ngoại (UV), tia X, tia nơtron hay electron.

Trong đó tác nhân vật lý hay được dùng vào mục đích này là ánh sáng tử ngoại (ƯV). Khả năng đột biến phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ. - Sinh học: tác nhân sinh học biến đổi gen.