Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 184.223 - Khóa luận Dược sĩ Đại học Dược Hà Nội

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN TIẾN TUẤN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES 184.223 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN TIẾN TUẤN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES 184.223 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu- người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo giúp đỡ tận tình để giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa hóa trường đại học khoa học tự nhiên Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót trong khóa luận. Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Tiến Tuấn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.

Đại cương về kháng sinh .Định nghĩa kháng sinh.Phân loại kháng sinh .Cơ chế kháng sinh .Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes). Phương pháp phân lập VSV sinh kháng sinh. Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật.

Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men. Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. Sản xuất 8- demethylgeldanamycin và 4,5- epoxy-8 demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus.

Sinh tổng hợp các chất tương tự geldanamycin để ức chế Hsp90. 10 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu .1 Giống xạ khuẩn .2 Vi sinh vật kiểm định.

3 Môi trường nuôi cấy .4 Dụng cụ và hóa chất .2 Phương pháp nghiên cứu .1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 184.2 Chọn lọc và cải tạo giống .3 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh .4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được. Phương pháp thực nghiệm. 15 CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT .Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp và VSV kiểm định .Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 184.Kết quả đột biến UV lần 1 .Kết quả đột biến UV lần 2 .Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc .Kết quả chọn dung môi chiết suất kháng sinh.Một số đặc điểm của Streptomyces 184.Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh .Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi .Kết quả sắc ký cột .Kết quả đo phổ IR, phổ UV, khối phổ MS và xác định sơ bộ các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được.

37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2'- deoxyribonucleic B.cereus Bacillus cereus DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh International Streptomyces Project ( chương ISP trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P.mirabilis Proteus mirabilis s Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào UV Ultra violet ( tử ngoại) V Thể tích VSV Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học. Cơ chế tác dụng của kháng sinh.

Các vi sinh vật kiểm định. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml). Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định. Các dung môi sử dụng.

Kết quả HTKS của bào tử Streptomyces 184. Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. Kết quả thử HTKS đột biến lần 2.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và 5 ngày. Kết quả HTKS pha DM và nước của 5 DMHC ở 5 pH. Các đặc điểm phân loại của Streptomyces 184.

Kết quả HTKS chọn môi trường lên men. HTKS dịch lên men của các dạng chủng và biến chủng trên MT2dt. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi. Kết quả thử HTKS các PĐ sắc ký cột lần 1 với hệ dung môi 3.

Kết quả SKLM các phân đoạn của sắc ký cột lần 1……………………33 Bảng 3. Kết quả SKLM dò hệ dung môi chạy sắc ký cột lần 2…………………34 Bảng 3. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 với hệ DM Ethylacetat: Methanol (40:1). Kết quả chạy sắc ký cột lần 3 với hệ DM Ethylacetat: Methanol (40:1).35 PHỤ LỤC Hình P.0 Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh.1 Đĩa Petri chứa xạ khuẩn Streptomyces 184.223 sau 6 ngày nuôi cấy.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương pháp khối thạch.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương pháp giếng thạch.4 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương pháp khoanh giấy lọc.5 Kết quả chạy SKLM (hệ 40:1) phân đoạn chính sau khi chạy sắc kí cột và sắc kí cột.6 Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces 184.7 Phổ tử ngoại vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.8 Phổ hồng ngoại vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.9 Phổ khối lượng vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.223 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh là nhóm thuốc có hiệu quả cao trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.

Nhờ tìm ra kháng sinh mà hàng loạt căn bệnh từng đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe và tính mạng loài người như các chứng viêm nhiễm, nhiễm khuẩn như lao, viêm phổi. được điều trị và khống chế có hiệu quả. Nhưng đáng tiếc là trước hiệu quả điều trị rất rõ ràng, hầu hết các bệnh nhân và nhiều thầy thuốc cũng đã lạm dụng kháng sinh, coi đây như thần dược. Thực tế không như vậy, đối với các trường hợp viêm nhiễm do virus và bệnh cúm, viêm não B… thì kháng sinh hầu như không có hiệu quả.

Hiện nay, sử dụng kháng sinh không đúng cách dẫn đến xuất hiện tình trạng kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh với nhiều cơ chế phức tạp. Vì vậy việc tìm ra kháng sinh mới ít độc tính, điều trị hiệu quả là rất cần thiết. Trong đó con đường truyền thống sàng lọc tìm kiếm kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn là con đường quan trọng trong việc phát hiện ra các chủng mới có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt, đồng thời tìm ra các hoạt chất mới có khả năng ức chế vi khuẩn kháng thuốc. Chi Streptomyces là một chi xạ khuẩn lớn, gồm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.

Do vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 184.223 ” với các mục tiêu sau:  Tạo biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao từ chủng giống Streptomyces 184.223  Bước đầu nghiên cứu hình thái Streptomyces 184.  Nghiên cứu điều kiện lên men, chiết tách và tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết.  Sơ bộ nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh thu được. Đại cương về kháng sinh 1.

Định nghĩa kháng sinh Theo Waksmann, kháng sinh được định nghĩa kinh điển: ‘Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác”. Phân loại kháng sinh Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng, hay theo phổ tác dụng…trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng phổ biển nhất. Các chất được phân loại theo cấu trúc hóa học chia làm 10 nhóm theo bảng 1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học.

STT Nhóm kháng sinh Ví dụ 1 β – lactam Amoxicillin,cephalosporin 1,2,3… 2 Phenicol Cloramphenico 3 Aminoglycosid Streptomycin, gentamicin…. 4 Tetracyclin Tetracyclin, doxycyclin. 5 Macrolid Erythromycin,clarithromycin, … 6 Polypeptide Polymycin, vancomycin,. 7 Imidazol Metronidazol,… 8 Lincosamid Lincomycin, clindamycin,.

9 Quinolon Các Floroquinolon 1,2,3,4 10 Nhóm khác Oxazolidinon 1. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [3] Các kháng sinh có một đích tác dụng khác nhau và hiện tại có 5 đích tác dụng trên VSV như sau: Bảng 1. Cơ chế tác dụng của kháng sinh Cơ chế tác dụng KS Ví dụ Tổng hợp thành tế bào β –lactam, glycopeptid Màng tế bào chất Polypeptid (colistin) Tổng hợp protein Nitrofuran, maclorid Tổng hợp acid nuclenic Phenicol,tetracyclin Ức chế chuyển hóa acid folic Co-trimoxazol 3 Trao đổi chất hô hấp Antimycin Cơ chế tác dụng được thể hiện ở phục lục P. Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh Để phân lập VSV sinh kháng sinh người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, bùn,… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những VSV sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng phương pháp đặc trưng và trên các môi trường chọn lọc.

Các phương pháp phân lập xạ khuẩn: - Phương pháp cấy dịch chiết lên bề mặt thạch. - Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn VSV kiểm định. - Phương pháp làm giàu đất - Phương pháp thêm kháng sinh vào môi trường phân lập. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt.

Chúng có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces).Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria). Đa số là vi khuẩn Gr (+), có tỷ lệ G+C > 55%, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty). Do đó, có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzyme, vitamin,.vì vậy, chúng được nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây hại cho người hoặc động vật.