Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183 - Khóa luận Dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ THÚY GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ THÚY GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN ThS. Lê Thị Thu Hương – Bộ -S ọ Tôi xin chân thà ộ ộ - S ọ ộ Đ ọ H ộ ị ễ m. ị Đ ọ H ộ ọ ọ ộ ị H ộ ă 0 4 Sinh viên HOÀ G HỊ HÚY MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.

Đại cƣơng về kháng sinh. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh. Định nghĩa kháng sinh. Ứng dụng của kháng sinh.

Nhu cầu phát triển kháng sinh mới. Đại cƣơng về xạ khuẩn. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.

Phân loại xạ khuẩn. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên.

Đột biến cải tạo giống. Bảo quản giống xạ khuẩn. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. Các phương pháp lên men.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men. Chiết tách và tinh chế kháng sinh. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh. Các phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng.

Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh. Phổ tử ngoại – nhìn thấy (phổ UV-VIS). Phổ hồng ngoại (phổ IR). Phân tích khối phổ.

Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh 11 1. Nghiên cứu kháng sinh natamycin sản xuất bởi Streptomyces lydicus (quá trình lên men, chiết suất, tinh chế và một số tính chất). ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nguyên vật liệu và thiết bị.

Nguyên vật liệu. Nội dung nghiên cứu. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được. Chủng giống, cải tạo giống.

Lên men, chiết tách kháng sinh. Phƣơng pháp thực nghiệm. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán.

Phân loại xạ khuẩn theo ISP. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp. Sàng lọc ngẫu nhiên. Đột biến bằng ánh sáng UV.

Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng……….

Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột và sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.

Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2…………………………………….

Kết quả chọn môi trường lên men chìm. Kết quả chọn chủng lên men. Độ bền với pH, nhiệt. Chiết suất và tinh chế kháng sinh từ dịch lọc.

Kết quả chọn pH chiết. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh. Kết quả chạy sắc ký cột lần 1.

Kết quả chạy sắc ký cột lần 2. Kết quả độ nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết. Nhiệt độ nóng chảy. Phổ tử ngoại.

Phổ hồng ngoại. 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 16S rADN 16S Ribosomal acid deoxyribonucleic 2 ADN Acid deoxyribonucleic 3 ATCC American type culture collection (Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ) 4 B.pumilus Bacillus pumilus 5 DM Dung môi 6 DMHC Dung môi hữu cơ 7 ĐB1 Đột biến lần 1 8 ĐB2 Đột biến lần 2 9 Gr(+) Gram dương 10 Gr(-) Gram âm 11 ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) 12 IR Investor relations 13 KS Kháng sinh 14 HTKS Hoạt tính kháng sinh 15 MS Mass Spectometry 16 MT Môi trường 17 MTdt Môi trường dịch thể 18 S.flexneri Shighella flexneri 19 UV-VIS Ultraviloet- Visible 20 SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên 21 VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Ký hiệu Nội dung Trang 1 Bảng 2.1 Các vi khuẩn kiểm định 13 2 Bảng 2.2 Các dung môi đã sử dụng 15 3 Bảng 3.1 Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.24 25 và Streptomyces lydicus 4 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.24 trên 26 MT1, MT2, MT6 5 Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của sàng lọc ngẫu 27 nhiên 6 Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của đột biến lần 1 28 7 Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của đột biến lần 2 29 8 Bảng 3.6 Kết quả chọn môi trường lên men chìm 30 9 Bảng 3.7 Kết quả chọn chủng lên men 30 10 Bảng 3.8 Độ bền của kháng sinh với nhiệt 31 11 Bảng 3.9 Độ bền của kháng sinh với pH 31 12 Bảng 3.10 Kết quả chọn pH chiết 32 13 Bảng 3.11 Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 33 14 Bảng 3.12 Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 34 15 Bảng 3.13 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của chạy cột 35 lần 1 16 Bảng 3.14 Màu sắc từ phân đoạn 7 đến 14 của sắc ký cột lần 1 35 17 Bảng 3.15 Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 36 18 Bảng 3.16 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của chạy cột 37 lần 2 19 Bảng 3.17 Kết quả của các chất kháng sinh tách được 37 20 Bảng 3.18 Kết quả IR 38 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh ra đời là một bước ngoặt quan trọng của y-dược học. Nhờ đó mà nhân loại đã chống lại được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, viêm phổi… Hiện nay, kháng sinh trở thành 1 nhóm thuốc thiết yếu.

Với nền khoa học ngày càng phát triển, nhóm thuốc kháng sinh không chỉ dừng lại ở chỉ định điều trị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm mà còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và HIV/AIDS với nhiều kết quả khả quan. Tuy nhiên, việc nghiên cứu kháng sinh mới đang có xu hướng giảm dần theo thời gian do chi phí, nhân lực còn hạn chế. Đó chính là nguyên nhân các hãng dược phẩm đang có xu hướng từ bỏ cam kết triển khai nghiên cứu thuốc kháng sinh mới. Trong khi đó, việc sử dụng kháng sinh chưa hợp lý gây ra tình trạng kháng thuốc ngày càng nghiêm trọng và xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng chéo với các kháng sinh có cấu trúc tương tự.

Do vậy, đẩy mạnh nghiên cứu kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấp thiết.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi chọn đề tài: ”Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183.24” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau đây: - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183. - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Xác định các điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh, sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.

Đại cƣơng về kháng sinh 1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Năm 1929 thuật ngữ "chất kháng sinh" được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và đã mở ra kỷ nguyên mới trong ngành y dược học, khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người [9],[15]. Thập niên 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc của ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt sự kiện như: Khám phá ra hàng loạt kháng sinh, như penicillin (1928), griseofulvin (1939), gramicidin S (1942), streptomycin (1943)… Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến (đặc biệt là các kỹ thuật gây đột biến, dung hợp tế bào, tái tổ hợp gen.) đã tạo ra những chủng có khả năng tổng hợp kháng sinh cao gấp nhiều lần so với ban đầu. Bên cạnh đó, tổng hợp và bán tổng hợp kháng sinh từ các khung hóa học sẵn có cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của chloramphenicol, cephalosporin bán tổng hợp, macrolid,… [9],[12],[19],[35].

Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn gốc tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa…) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [4],[7],[8],[9],[15],[19].1 trình bày một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra. Ứng dụng của kháng sinh - Lĩnh vực y học: Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm [8]. 3 - Lĩnh vực khác  Trong chăn nuôi: kháng sinh được dùng để chữa bệnh cho động vật. Ví dụ: griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú ở trâu bò… Ngoài ra kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, ăng sản lượng trứng cho gà, vịt…  Trong trồng trọt: hiện nay có khoảng 30 chất kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng.

Ví dụ: Blastincidin S (kháng sinh chiết từ S. griseochromogenes), ở Nhật dùng để trị bệnh vàng lụi gây ra bởi Piricularia oryzae, Herbicidin A và B là kháng sinh diệt cỏ do S.saganonensis tạo ra, nó kìm hãm sự phát triển của Xanthomonas oryzae gây bệnh ở lúa…  Trong công nghiệp thực phẩm: kháng sinh được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp, cho thêm kháng sinh vào nhằm giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt. Ví dụ: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra) [7]. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới Một trong các thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và các chất kháng VSV.

Tuy nhiên, các VSV đã và đang phát triển tính kháng với các kháng sinh hiện có bằng các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền.