Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 119 112

T> T 'T t O Pr r v Ằ A T A o VX Ti lPj ŨỤ uo iTnÁ u lỹỤv^ Oc £/A w ir \v j P Ô J-J TRƯỜNG ĐẠI • HỌC • D ược • HÀ NỘI • PHẠM • THỊ• HẠNH • NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 119.112 LUẬN • VĂN THẠC • s ĩ Dược • HỌC • CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ Dược PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ : 60.01 Ngườỉ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Cao Văn Thu Ị TRƯỜNG ĐM DƯỢC HÀ NỘI Ị T H Ư V I ỆIM ^ Ị í N g ày Ih ố n g n ă iT i ị SỐĐKCB:___ __ _____ .,^ HÀ NỘI 2010 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS. TS Cao Văn Thu, người đã trực tiếp hướng dẫn ân cần chỉ bảo giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Em cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, cán bộ kĩ thuật viên bộ môn Vi sinh và Sinh học, bộ môn Công nghiệp dược trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên em trong suốt thời gian qua.

Do thời gian có hạn, nên trong bài luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong được sự chỉ bảo của thầy cô và sự góp ỷ của các bạn. Em xin chân thành cảm om / Hà Nội ngày 29 tháng 10 năm 2010. Học viên Phạm Thị Hạnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đ Ề .1 CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN.

Đại cương về xạ khuẩn. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn. Phân loại Streptomyces. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces.

Cải tạo giống vi sinh v ậ t. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. Chiết tách và tinh chế. Phổ hồng ngoại, phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

Phổ hồng ngoại (IR). Phổ khối lượng (M S). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NM R).13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u. Đối tượng nghiên cứu.

Giống xạ khuẩn. Vi sinh vật kiểm định. Môi trường nuôi cấ y. Dụng cụ và hoá chất.

Phương pháp nghiên cứ u. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán. Phương pháp cải tạo và chọn giống.

Phương pháp lên men chìm và đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lọc dịch lên m en. Các phương pháp chiết tách kháng sinh. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP.27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM. Nâng cao khả năng sinh tổng họp kháng sinh của Streptomyces 119.

Kết quả sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 119.112 trên các môi trường khác nhau:. Kết quả cải tạo giống. Kết quả lên men chìm:. Bước đầu khảo sát các thành phần môi trường lên men.

Kết quả chiết tách và tinh chế kháng sinh. Kết quả chiết kháng sinh bằng các dung môi hữu cơ ở các pH khác nhau:. Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng sắc ký lóp mỏng: 44 3. Kết quả chạy sắc ký cột:.

Kết quả phổ hồng ngoại, phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Kết quả đo phổ hồng ngoại (IR ). Phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Phân loại Streptomyces 119.57 CHƯƠNG 4: BÀN LU Ậ N.

Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 119. Nghiên cứu một số tính chất thành phần kháng sinh chính do Streptomyces 119.112 sinh tổng hợp. Phân loại Streptomyces 119. 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH Ị.

61 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIÉT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic Z) Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn ISP International Streptomyces Project MT Môi trường MTdd Môi trường dung dịch s Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh HTKS Hoạt tính kháng sinh RF Rectiflexibiles : thẳng hơi cong vsv Vi sinh vật VK Vi khuẩn c 1, C2 Giống cấp 1, cấp 2 NST Nhiễm sắc thể uv Utra Violet (tử ngoại) V Thể tích Dm Dung môi IR Infrared (hồng ngoại) DANH MỤC CÁC BẢNG • Bảng 1.1: Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces. 1 :Các vi sinh vật kiểm định.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml). Môi trường nuôi cấy vsv kiểm định. Các dung môi sử dụng.1: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh với 10 v s V kiểm định.2:Kết quả chọn lọc tự nhiên chủng Streptomyces 119.3: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần 1.4: Kết quả đột biến lần 2 .5: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng sinh trong các môi trường lên men 40 Bảng 3.6: Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trong môi trường MTldd.7: Các thành phần môi trường (g/100ml).8: Kết quả lên men trong 16 môi trường trên.

Kết quả chiết kháng sinh bằng các dung môi hữu cơ ở các pH khác 44 nhau.10: Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng sắc ký lớpmỏng.11: Kết quả thử các phân đoạn sắc ký cột.12: Kết quả sắc kí lóp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính.13: Kết quả chạy SKLM với hệ 5.14: Kết quả sắc ký cột lần 2 .15: Kết quả sắc ký lóp mỏng.16: Kết quả phổ NMR của H-l và actinomycin D .17: Các đặc điểm của Streptomyces 119.112 và Streptomyces citreus. 58 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 :Sơ đồ biện giải phổ NMR.1: cấu trúc hóa học của Actinomycin D Hình 3.2: Một số tương tác HMBC của H -l. ĐẶT VẤN ĐÈ • Từ khi kháng sinh được tìm ra và ứng dụng rộng rãi đã có rất nhiều căn bệnh do nhiễm trùng từng bị coi là nan y đã được chữa trị thành công. Nhưng các nghiên cứu cho thấy ngày càng có nhiều chủng gây bệnh kháng lại các kháng sinh đã có sẵn, nhiều kháng sinh đã không còn tác dụng trên một số chủng gây bệnh nữa.Vì vậy việc tìm ra kháng sinh mới là vấn đề cần thiết và được toàn thế giới quan tâm hiện nay.

Ngày nay với sự phát triển của công nghệ, khoa học kĩ thuật, kháng sinh mới thường được nghiên cứu phát hiện và tổng hợp theo 3 hướng chính : tổng họp hoá học, bán tổng hợp và sinh tổng họp. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp kháng sinh rất đa dạng và phong phú có thể là vi khuẩn, xạ khuẩn hay nấm. Trong đó thì chi xạ khuẩn Streptomyces là có nhiều xạ khuẩn có khả năng tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn hon cả. Ngoài ra một số loài xạ khuẩn trong chi này còn tổng hợp các chất chữa ung thư như Streptomyces antibỉotỉcus sinh tổng họp Actinomycin D được phát hiện đầu tiên năm 1952.

Do đó, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu sinh tằng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 119.112” với các mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu chất kháng sinh chỉnh do Streptomyces 119.112 sinh tổng hợp 2. Bước đầu xác định cấu trúc thành phần kháng sinh chính 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Đại cương về xạ khuẩn 1.

Đặc • điểm sinh học • của xạ • khuẩn 1. Đặc điểm chung Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn thực, có một sổ đặc tính đặc biệt. Chúng có khuẩn lạc khô và có thể có dạng tia phóng xạ phát triển dạng sợi phân nhánh như nấm. Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân nguyên thuỷ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo thành nhiều bào tử.Thậm chí một số loại xạ khuẩn còn hình thành nang bào tử như chi Streptosporangium và bào tử di động như Actinoplanes.

Tuy có đặc điểm phát triển dạng sợi phân nhánh nhưng xạ khuẩn đã được chứng minh là vi khuấn với những bằng chứng: không có nhân thật, chỉ có vùng nhân, thường không có vách ngăn, nhạy cảm với kháng sinh tác dụng lên vi khuẩn. Đa số xạ khuẩn thuộc nhóm Gram (+), tỷ lệ G + c > 55%, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty). Xạ khuẩn có khả năng sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzym, một số vitamin và acid hữu cơ. Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật và cây trồng.

Đặc điếm phân loại của chi Streptomyces * Đăc điểm hình thải - Khuẩn lạc: Khuẩn lạc của xạ khuẩn Streptomyces rất đặc biệt, tạo thành cụm, bề mặt khô, xù xì, có thể có các nếp, hoặc toả ra theo hình phóng xạ. Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách khỏi môi trường nuôi cấy. - Hệ sợi của xạ khuẩn'. Đường kính của khuẩn ty khoảng từ 0,2 - l,0(im đến 2,0fim.

Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày khoảng từ 10- 20nm, 2 không có cellulose, kitin, có tác dụng duy trì hình dáng khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Màu sắc khuẩn ty phong phú: trắng, vàng, đỏ, lục, tím, nâu, đen. Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành khuẩn ty khí sinh, có đường kính từ 1,0- l,4|im.

Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện chuồi bào tử. Chuỗi bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, uốn cong, lượn sóng, móc đơn, móc vòng, xoắn lò xo.Các chuỗi bào tử này phân cắt thành bào tử trần. Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuấn.Bào tử trần có thế có hình cầu, hình bầu dục, hình trụ.Các bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi 30- 50 bào tử hoặc nhiều hơn. Be mặt bào tử có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha).[5], [10], [12] * Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hoá cao.

Đe phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột.Chúng cũng có thể khử nitrat thành nìtút.Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của chúng thường là 25- 30°c, một vài loài có thể phát triển tốt ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu thường từ 6 ,8 - 7,5. Khả năng tạo sắc tố: khả năng tạo sắc tố từ Streptomyces được chia thành 4 loại: sắc tố hoà tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh (màu sắc của bề mặt khuẩn lạc), sắc tố melanin. Phân loại Streptomyces 1.