Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme tannase từ nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn

“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Phạm Hoài Thu Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật 0 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” MỞ ĐẦU Ngày nay cùng với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme đã được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế,… Trong thực tế, việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử. Theo thống kê, hàng năm lượng enzyme được sản xuất ra trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD và được ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt trong ngành công nghiệp thực phẩm, các chế phẩm enzyme được sử dụng phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucose oxydase. Trong lĩnh vực sản xuất đồ uống, một vấn đề đang thu hút được nhiều quan tâm đó là vấn đề đục cặn trong các sản phẩm.

Nguyên nhân là do trong thành phần nguyên liệu được lựa chọn để sản xuât đồ uống chứa hàm lượng tannin quá cao vẫn chưa được xử lý. Tannin có nhiều trong trái cây, rau quả ăn được và chúng thường được coi là thành phần không mong muốn, vì gây ra những vấn đề công nghệ do tạo thành phức hợp với tinh bột, protein, enzyme tiêu hóa làm giảm giá trị cảm quan và dinh dưỡng của thực phẩm. Do đó, ứng dụng chế phẩm enzyme tannase trong sản xuất đồ uống từ các loại quả giàu tannin có thể nâng cao chất lượng sản phẩm. Ngoài ra trong các ngành công nghiệp thuộc da thì trong thành phần của nước thải rất giàu tannin, chất béo, protein,… Hiện nay thì người ta đã sử dụng một số enzyme như enzym lipase để phân giải chất béo, enzym protease kiềm tính để phân giải protein, còn hàm lượng tannin trong nước thải thì hầu như vẫn chưa được được xử lí.

Vì vậy, sử dụng enzym tannase phân giải tannin trong giai đoạn xử lí sinh học cho phép xử lí nước thải trong các ngành công nghiệp thuộc da triệt để hơn. Từ những nhu cầu cấp thiết ở trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tannase từ các chủng nấm mốc Aspergilllus theo phương pháp lên men rắn”, với các mục tiêu sau: Phạm Hoài Thu Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật 1 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Mục tiêu của đề tài - Phân lập, tuyển chọn được chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme tannase cao. - Nghiên cứu điều kiện lên men tạo emzyme tannase theo phương pháp lên men rắn. Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu đặt ra, chúng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu sau: - Phân lập và lựa chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp emzyme tannase cao từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.

- Lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme tannase bằng phương pháp lên men rắn. - Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp sinh tổng hợp emzyme tannase cao. Phạm Hoài Thu Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật 2 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” CHƢƠNG 1. Enzyme tannase Enzyme tannase hay còn gọi là acyl tannin hydrolase (EC 3.

Đây là một enzym thủy phân hoạt động trên nguồn cơ chất là tannin, có khối lượng phân tử khoảng 150 kDa đến 300 kDa tùy thuộc nguồn enzyme.1: Khối lƣợng phân tử và hàm lƣợng carbohydrat của tannase Vi sinh vật Khối lƣợng Hàm lƣợng Tài liệu tham khảo phân tử (Da) cacbohydrat (%) Aspergillus 192 000 25,4 Yamada et al, 1968; flavus Adachi et al, 1971 Aspergillus 186 000 43 Barthomeruf et al, 1994; oryzae Parthasarathy & Bose, 1976 Aspergillus 300 000 22,7 Hatamoto et al, 1996; niger Abdel – Naby et al, 1999 Candida sp.K-1 250 000 61,9 Akio et al, 1976 Chryphonectria 240 000 64 Akio et al, 1976 parasitica Gỗ sồi 300 000 Chưa xác định Niehaus et al, 1997 Peduculate Nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ enzyme trong khoảng 35- 60oC và pH tối ưu 3,5- 8 tùy thuộc vào nguồn enzym. Enzyme tannase ổn định trong một vài tháng ở 30oC. Tannase có điểm đẳng điện là 3,8. Enzyme tannase xúc tác thủy phân các liên kết este và liên kết depside có trong các tannin thủy phân để tạo thành glucose và axit gallic.

Ngoài ra, enzyme tannase còn xúc tác thuỷ phân liên kết este có mặt trong các hợp chất tannin như axit tannic, metyl gallate, etyl gallate, n-propylgallate và izoamylgallate. Phản ứng Phạm Hoài Thu Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật 3 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” xúc tác điển hình của tannase là phá vỡ cầu nối hydro của epigallocatechin-3-ol gallate. Theo nghiên cứu của Libuchi et al, 1972 tannase có thể thuỷ phân hoàn toàn axit tannic (I) thành axit gallic và glucose thông qua 2,3,4,6 tetragalloyl glucose (III) và hai kiểu của monogalloyl glucose (IV).1: Con đƣờng thuỷ phân axit tannic bởi enzyme tannase 1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của enzyme tannase 1.

Ảnh hƣởng của pH Hoạt độ xác tác của enzyme phụ thuộc nhiều vào giá trị pH của môi trường. Enzyme từ các nguồn khác nhau có khoảng pH thích hợp khác nhau. Ví dụ, enzyme tannase được phân lập từ nấm mốc Aspergillus niger có pH tối ưu nằm trong khoảng từ 5,0 – 6,0 và hoạt động ổn định trong khoảng rộng từ 3,5 – 8,0. Enzyme Phạm Hoài Thu Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật 4 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” tannase phân lập từ Chryphonectria parasitica có pH tối ưu là 5,5 (Libuchi et al, 1968), từ Candida sp có pH tối ưu 6,0 và hoạt độ ổn định ở phạm vi rộng pH 3,5 – 7,5 (Akio et al, 1976).

Tannase thực vật phân lập từ cây sồi Penduculate có phạm vi pH rộng với pH tối ưu khoảng 5,0. Ngay cả khi enzyme này được ủ trong 24h ở pH là 5,0 thì hoạt độ vẫn duy trì và ổn định tốt (Madhavakríhna & Bose, 1962). Ảnh hƣởng của nhiệt độ Hoạt độ xúc tác của enzyme tăng khi tăng nhiệt độ phản ứng, nhưng chỉ trong một vùng nhiệt độ giới hạn. Theo các nghiên cứu trước đây, tùy vào các chủng và phương thức nuôi cấy mà enzyme tannase có dải nhiệt độ tối ưu 30 - 60oC.

Nhiệt độ tối ưu và ổn định của tannase phân lập từ các sinh vật khác nhau được thể hiện trong bảng sau: Bảng 1.2: Nhiệt độ tối ƣu và ổn định của enzym tannase Vi sinh vật Nhiệt độ tối Nhiệt độ ổn Tài liệu tham khảo ƣu định Tannase từ nấm mốc Aspergillus flavus 50 -60oC ≤ 70oC Yamada et al,1968; Pourrat et al,1982 Aspergillus oryzae 30 – 40oC 55oC Beverini và Metche, 1990; Libuchi et al,1968 Aspergillus niger 35oC ≤ 50oC Haslam và Tanner, 1970 Tannase từ vi khuẩn Penicillium 30 -40oC 45oC Rajakumar và Nandy, chrysogenum 1983 Chryphonectria 30oC 25 – 40oC Farias et al,1992; Phạm Hoài Thu Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật 5 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” parasitica Libuchi et al, 1968 Tannase từ nấm men Candida sp.K-1 1 1 Tannase từ thực vật gỗ sồi Peduculate 35 và 40oC ≤ 50oC Niehaus và Gross, 1997 1. Ảnh hƣởng của ion kim loại Một số nghiên cứu đã cho thấy enzyme tannase được hoạt hóa bởi một số kim loại Ca2+, Fe2+, Na+, Mg2+ và Hg+( N. Jay Raju ,2007) còn một số ion khác như Ba2+, Ca2+, Zn2+, Hg2+, Ag+,…lại ức chế hoạt tính của tannase (Alevden_Z öztürk ,2006) 1. Ảnh hƣởng của chất nền Ảnh hưởng của nồng độ chất nền axit tannic trong môi trường nuôi cấy tới sinh trưởng và tổng hợp tannase của vi sinh vật đã được nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Khi tăng nồng độ cơ chất cảm ứng axit tannic trong môi trường nuôi cấy sẽ tăng cường khả năng sinh tổng hợp enzyme tannase. Nếu nồng độ chất cảm ứng tannic cao sẽ gây ức chế sinh trưởng vi sinh vật dẫn tới hoạt tính tannase được tổng hợp cũng giảm theo (Ruth Belmares , 2004) 1. Các nguồn thu nhận enzyme tannase 1. Nguồn tannase từ thực vật Các loài thực vật giàu tannin có hàm lượng enzyme tannase cao.

Trong thực tế, các loại thực vật giàu tannin thuỷ phân và tannin ngưng tụ được sử dụng làm nguồn chính để thu nhận enzyme tannase. Các thành phần này nằm trong những mô riêng biệt trong cây (Lekha và Lonsane, 1997). Enzyme tannase nằm trong vỏ cây Phạm Hoài Thu Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật 6 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” và lá của thực vật. Một số thực vật có chứa hàm lượng tannin cao như: quả Myrobolan (Terminalia chebuna), quả Divi Divi (Caesalpinia coriaria), gỗ sồi (Quercus rubra) và từ lá của cây Karee (Rhus typhina)….

Nghiên cứu vai trò của enzyme tannase trong thực vật Madhavakrishna et al (1960) đã cho rằng khi sinh trưởng thực vật tổng hợp một lượng lớn các axit gallic, axit chebulinic và axit hexahydroxyphenic bị este hoá với glucose dưới sự xúc tác của tannase để tạo thành các tannin phức tạp. Khi cây có hiện tượng rụng quả thì hoạt động của liên kết este trong tannase góp phần tích cực vào việc thuỷ phân tannin. Mặt khác, thành phần tannin giúp cho thực vật có thể tự bảo vệ mình chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật và sự tấn công của động vật ăn cỏ. Khi lá của thực vật bị tấn công bởi thực vật ăn cỏ thì các tế bào bị mất một số phần làm cho tannase tiếp xúc với tannin trong lá và thuỷ phân tannin thành các chất độc hại trong thực vật bậc cao.

Nguồn enzyme tannase từ động vật Đã có một số nghiên cứu chỉ ra rằng có một lượng nhỏ enzym tannase được tìm thấy ở niêm mạc dạ cỏ của gia súc, ví dụ như màng niêm mạc và ruột non của bò. Ngoài ra, tannase còn được sản sinh bởi các ấu trùng nốt sần phát triển trong nốt sần thực vật để thuỷ phân axit tannic (Lekha và Lonsane, 1997). Nguồn enzym tannase từ vi sinh vật Vi sinh vật là nguồn cung cấp enzym vô cùng quan trọng. Tannase từ nấm mốc hoạt động tốt hơn trong việc làm giảm tannin thuỷ phân, trong khi đó tannase từ nấm men lại làm giảm axit tannic tốt hơn và có ái lực thấp với tannin tự nhiên (Deschamps et al, 1983).

Nhiều tác giả đã chứng minh nấm sợi có khả năng phân giải tannin như một nguồn cacbon duy nhất (Lewis & Starkey, 1969; Hadi et al, 1994).