Nghiên cứu sinh tổng hợp Chitinase từ nấm Trichoderma - Đại học Vinh

Tr-êng ®¹i häc vinh khoa hãa häc ===  === ®å ¸n tèt nghiÖp §Ò tµi: Nghiªn cøu SINH TỔNG HỢP chitinase tõ nÊm Trichoderma GV h-íng dÉn : ThS. ®µo thÞ thanh xu©n SV thùc hiÖn : nguyÔn thÞ t©m Líp : 48K - C«ng nghÖ thùc phÈm M· sè SV : 0752040590 VINH - 12/2011 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn ThS. Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô, cán bộ hướng dẫn thí nghiệm phòng Hóa Thực Phẩm, Phòng Hóa Vô Cơ, Trung tâm Kiểm đạt chất lượng Môi Trường và Thực Phẩm Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các bạn cùng phòng thí nghiệm Thực Phẩm đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm đồ án tốt nghiệp. Vinh, tháng 12 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Tâm BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC ---------------------------- ------------------------- NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Tâm Số hiệu sinh viên: 0752040590 Khóa: 48 Ngành: Công nghệ thực phẩm 1. Tên đề tài: NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ NẤM TRICHODERMA 2.

Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp:. Họ tên cán bộ hướng dẫn : ThS. Đào Thị Thanh Xuân 4. Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày 01 tháng 07 năm 2011 5.

Ngày hoàn thành đồ án : Ngày 15 tháng 12 năm 2011 Ngày tháng năm 2011 Chủ nhiệm bộ môn Cán bộ hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm 2011 Người duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC ---------------------------- ------------------------- BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Tâm Số hiệu sinh viên: 0752040590 Khóa: 48 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS. Đào Thị Thanh Xuân Cán bộ duyệt: PGS. Nguyễn Hoa Du 1. Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… 2.

Nhận xét của cán bộ hướng dẫn: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2011 Cán bộ hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC ---------------------------- ------------------------- BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Tâm Số hiệu sinh viên: 0752040590 Khóa: 48 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS. Đào Thị Thanh Xuân Cán bộ duyệt: PGS. Nguyễn Hoa Du 1. Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… 2.

Nhận xét của cán bộ duyệt: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2011 Cán bộ duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU. Lí do chọn đề tài. Nhiệm vụ nghiên cứu. Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu.

Ý nghĩa khoa học của đề tài. TỔNG QUAN. Giới thiệu về vi nấm Trichoderma. Đặc điểm hình thái.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học. Dinh dưỡng và con đường trao đổi chất cơ bản của Trichoderma. Nguồn dinh dưỡng khác. Oxi và CO2.

Ảnh hưởng của yếu tố bên ngoài lên sự phát triển của Trichoderma. Cấu trúc ở mức tế bào - phân tử. Vách tế bào. Bào quan và màng tế bào.

Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma. Trong nông nghiệp. Trong lĩnh vực xử lý môi trường [24]. Trong công nghiệp thực phẩm [5].

Bổ sung thức ăn gia súc. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen [6]. Tình hình nghiên cứu và khả năng ứng dụng Trichoderma ở Việt Nam. Cấu trúc của hệ enzyme Chitinase.

Cấu trúc enzym chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18. Cấu trúc enzym chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19. Các đặc tính cơ bản của enzym chitinase. Trọng lượng phân tử [43].

Điểm đẳng điện - phổ hấp thụ - số Michaelis. Ảnh hưởng của nhiệt độ. Ảnh hưởng của pH [35]. Chất tăng hoạt - Chất ức chế.

Ổn định hoạt tính [34]. Các loại cơ chất của enzym Chitinase. Các dẫn xuất của Chitin [33, 34]. Cơ chế tác dụng và cảm ứng của hệ enzym chitinase.

Cơ chế cảm ứng. Nguồn thu nhận Chitinase. Chitinase vi khuẩn [35]. Chitinase thực vật.

Chitinase động vật [34]. Ứng dụng của chitinase. Trong nông nghiệp. Trong y dược và các ngành công nghiệp khác.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu và môi trường. Các môi trường dinh dưỡng. Môi trường tuyển chọn.

Môi trường giữa giống: PGA (potato Glucose Agar). Môi trường nuôi cấy: gồm 3 loại môi trường. Hóa chất và thiết bị. Phương pháp nghiên cứu.

Điều kiện nuôi cấy. Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống [1, 8]. Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp enzyme chitinase. Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm.

Xác định hàm lượng glucosamin (phương pháp Elson-Morgan). Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme chitinase. Nuôi cấy chủng Trichoderma trên một số môi trường. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase.

Ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp chitinase.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Tuyển chọn các chủng Trichorderma có khả năng sinh tổng hợp Chitinase. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp trên một số môi trường. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp enzyme.

Ảnh hưởng của pH môi trường. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ.

60 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 62 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. Cách pha các dung dịch glucosamin chuẩn có nồng độ 10- 250µg/ml. Khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng vi nấm Trichoderma.

Ảnh hưởng của môi trường đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của pH môi trường đến quá sinh tổng hợp chitnase. Ảnh hưởng của chitin điều chế đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nồng độ chitin (Wako - Nhật Bản).

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng nitơ trong dịch nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp chitinase. 58 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát triển trên môi trường PDA (Vùng màu xanh chứa bào tử) [48].

Hình thái khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma Harzianum. Vị trí thủy giải phân tử chitin bởi enzyme chitinase. Sơ đồ phân cắt chitin bởi enzyme thuộc nhóm chitinase. Mô hình cấu trúc Không gian của enzyme chitinase Serratia marcescens.

Mô hình cấu trúc không gian của chitinase Hodeum Vulgale. Cấu trúc hóa học của Allosamidin và dẫn xuất Allosamidin. Cấu trúc hóa học của chitin. Các dạng lập thể của chitin.

Cơ chế thủy giải tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase. Các vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme chitinase tại trung tâm hoạt hóa. Trichoderma phát triển trên môi trường PGA. Cường độ màu ở các nồng độ khác nhau.

Chitin huyền phù 1%. Đường chuẩn Glucosamin (nồng độ Glucosamin μg/ml). Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình sinh tổng hợp chitinase.

Ảnh hưởng của nồng độ chitin điều chế đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nồng độ chitin (Wako- Nhật Bản) đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ đến quá trình sinh tổng hợp chitinase.

59 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein, có cấu trúc phân tử phức tạp và tinh vi, hoạt lực xúc tác cao hơn nhiều so với chất xúc tác thông thường, có tính đặc hiệu cao. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều, chúng có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, y học, nông nghiệp. Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng 300.000 tấn với giá trị trên 1 tỷ USD.

Vi sinh vật là sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong tự nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống sản xuất. So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo quy mô công nghiệp. Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase,.

Những năm sau này người ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme thủy phân chitin. Chitin là một polymer sinh học, có thể so sánh với các polysaccharide như cellulose, keratin. Chitin phân bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngoài của tôm, cua và côn trùng. Đây là một polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước, chứa 2 các đơn phân là N - acetyl - glucosamin liên kết bởi liên kết 1 - 4 - β chitin có nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp.

Những enzyme liên quan đến chuyển hóa và phân giải chitin đang được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Chitin bị phân giải bởi hệ enzyme chitinase.