Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN NAC2LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN NAC2 LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:GS. LÊ TRẦN BÌNH THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 3 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn.Hạn hán có ảnh hưởng xấu ở các mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của cơ thể thực vật dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây chết. Hiện nay trên thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán.

Tại Việt Nam, trong 7,3 – 7,4 triệu ha đất trồng thì có tới 1,5 – 1,8 triệu ha bị thiếu nước. Nghiên cứu bản chất tính chống chịu của cây trồng cho thấy đây là một tính trạng đa gen. Vai trò cụ thể của từng gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu ở thực vật(ví dụ P5CS, RD22…) đã được nhiều nghiên cứu tìm hiểu và phân tích. Tuy nhiên, dưới tác động của các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không chỉ các gen riêng rẽ được biểu hiện mà là một hệ thống các gen liên quan được kích hoạt biểu hiện nhằm đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải.

Một trong số những yếu tố kích hoạt hoạt động của các gen liên quan đến khả năng chống chịu là các nhân tố phiên mã (transcription factor – TF). Họnhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) là một trong những họ TF đặc trưnglớn nhất trong hệ genthực vật [106].Nhân tố phiên mãNAC có liên quan đếnnhiều quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể thực vật [99]. Nhiều gen NAC tham gia vào phản ứng với những áp lực khác nhau từ môi trường,trong đó có hạn [87], [113], [133]… Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mãNAC thành công vào một số loài cây trồng như: cây lúa, lúa mỳ, thuốc lá,.Trên đối tượng cây lạc,các gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn đã được tách dòng thành công [71], AhNAC2 đã được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc gen chịu hạn và chuyển thành công vào cây Arabidopsis [72]. Lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày được trồng phổ biến trên thế giới.

Ở nước ta, cây lạc được trồng trên khắp các miền và phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh vẫn là yếu tố hạn chế đối với sự sinh trưởng và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 4 năng suất của cây trồng trong đó có cây lạc. Cây lạc là cây họ đậu, thuộc nhóm chịu hạn kém [13].Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả năng chịu hạn như lai giống hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng [11], [13], [14], [15].Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra những giống lạc có khả năng chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều.Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)”nhằm thử nghiệm khả năng chuyển gen chỉ thị và tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo ra dòng cây chuyển gen phục vụ chọn giống chịu hạn ở cây lạc. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhằm cải tạo cây lạc và cải thiện về khả năng chống chịu trên đối tượng cây trồng này.

Mục tiêu nghiên cứu (1) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt. (2) Thiết kế được vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2. Tạo cây chuyển gen và biểu hiện được protein NAC2 ở cây thuốc lá. (3) Tạo được dòng cây lạc chuyển gen.

Phân tích các dòng cây lạc chuyển gen. Nội dung nghiên cứu (1) Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mô sẹo và cây non. (2) Phân lập, tách dòng và giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên quan đến tính chịu hạn của cây lạc. (3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mãNAC2, tạo vi khuẩn A.tumefaciensmang vectortái tổ hợp và chuyển vào cây thuốc lá mô hình.

(4) Xác định sự có mặt của gen chuyển NAC2 trên cây thuốc lá, đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen thông qua sự thay đổi hàm lượng proline. Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp NAC2 ở cây thuốc lá chuyển gen. (5) Phát triển hệ thống tái sinh cây ở cây lạc và chuyển gen chỉ thị (GUS) qua mô sẹo và phôi soma. (6) Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2vào cây lạc, phân tích các dòng lạc chuyển gen.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www. Những đóng góp mới của luận án i) Tách dòng thành công gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt L12. ii) Thiết kế thành công vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 và chuyển vào cây thuốc lá, kết quả biểu hiện protein ở cây chuyển gen chứng minh cấu trúc đã thiết kế hoạt động tốt ở thuốc lá. iii) Thông qua hệ thống tái sinh đã xây dựng, luận án tối ưu và hoàn thiện được quy trình chuyển gen hoàn chỉnh thông qua mô sẹo và phôi soma ở cây lạc nhằm phục vụ tạo cây lạc chuyển gen theo mục đích cải thiện khả năng chống chịu với tình trạng thiếu nước từ môi trường.

Giống lạc LVT được thử nghiệm chuyển gen GUS và chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5. Ý nghĩa khoa học i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm phục vụ việc cải thiện tính chịu hạn của cây lạc. ii) Cung cấp thông tin về nhân tố phiên mã NAC và gen NAC2 ở cây lạc.

Khả năng chịu hạn ở các giống lạc nghiên cứu và vai trò của gen NAC2 trong đáp ứng với sự thiếu nước từ môi trường. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây lạc ở mức độ mô sẹo và cây non được sử dụng làm cơ sở để đánh giá và ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng chịu hạn của cây lạc. Kết quả thu được ban đầu về cây lạc chuyển gen sẽ làm căn cứ để đánh giá ở các mức độ tiếp theo nhằm phục vụ các nghiên cứu về cải thiện tính chịu hạn của cây lạc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 6 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN THỰC VẬT 1. Tác động của hạn đến thực vật và cây lạc 1. Cây lạc Cây lạc có nguồn gốc ở vùng Nam Bolivia, Tây bắc Achentina, Nam Mỹ. Người Bồ Đào Nha đưa cây lạc từ Brazin sang Tây Phi và sau đó đến Tây Nam Ấn Độ từ thế kỉ XVI.

Sau đó được đem trồng ở rất nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, cây lạc được du nhập từ Trung Quốc sang và được trồng vào khoảng thế kỉ XVII- XVIII [8], [13]. Về mặt phân loại, cây lạc có tên khoa học là Arachis hypogaea (L. Theo Krapo Vikas và một số tác giả khác, cây lạc thuộc họ cánh bướm Fabaceae, thuộc chi Arachis.

Loài lạc trồng Archis hypogaea (L.) gồm hai loài phụ: Loài phụ Hypogaea gồm hai chủng: Hypogaea loại hình Virginia và Bersuta kohter. Loài phụ Fastigiata gồm hai chủng: Fastigiata loại hình Valencia và Vulgaris harz loại hình Spanish. Về hình thái, cây lạc gồm các bộ phận chính là rễ, thân, lá, hoa và quả lạc. Rễ lạc có rễ cọc và rễ con.

Trên rễ lạc có nhiều nốt sần được tạo thành do vi khuẩn Rhizobium sống cộng sinh, do vậy cây lạc có khả năng cố định nitơ phân tử trong không khí thành đạm cung cấp cho cây và đất trồng. Những nốt sần này tăng nhanh về số lượng và kích thước từ khi cây lạc có 6 - 7 lá đến lúc nở hoa.Thân chính của cây lạc thường chỉ cao khoảng 25cm - 50cm. Lá lạc là loại lá kép hình lông chim có 4 lá chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược, có 2 lá kèm hình dải nhọn bao quanh thân. Trên thân chính thường có khoảng 20 lá.

Khi cây lạc có 5 - 6 lá trên thân chính thì lạc bắt đầu phân hoá các mầm hoa. Hoa lạc mọc ra từ các mắt của cành. Mỗi vị trí có thể có từ 3 - 5 hoa, khi cây lạc đã có 8 - 9 lá thì hoa nở. Lạc là loại cây tự thụ phấn nghiêm ngặt, khi thấy hoa nở là cây đã thụ phấn xong.

Hoa lạc sau khi thụ phấn thì đâm tia xuống đất hình thành quả (thường gọi là củ). Quả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 7 lạc có hình trụ thuôn thắt lại ở giữa các hạt, vỏ quả cứng có gân mạng. Mỗi quả có 1 - 3 hạt. Hạt hình trứng, có vỏ lụa màu đỏ, vàng, cánh sen hoặc trắng [13].

Theo thời gian sinh trưởng của cây lạc, người ta chia làm giống chín sớm (thời gian sinh trưởng 90 ngày - 125 ngày) và giống chín muộn (140 ngày - 160 ngày). Cây lạc đòi hỏi khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển của cây lạc từ 240C - 330C. Nhiệt độ để hạt nảy mầm thấp nhất phải trên 120C, từ 150C hạt lạc đã bắt đầu nảy mầm tốt, dưới 170C hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm từ 60% - 70%, độ ẩm thấp dưới 60% đã kéo dài thời gian nảy mầm và hạt không nảy mầm được ở độ ẩm đất 40% - 50%. Đất trồng lạc lí tưởng phải là đất thoát nước nhanh, chân đất nhẹ, thoáng, có màu sáng, tơi xốp, phù sa pha cát có đầy đủ canxi và lượng chất hữu cơ vừa phải sẽ tạo điều kiện cho lạc nảy mầm, dễ dàng ngoi lên mặt đất và sinh trưởng, hình thành quả tốt, độ pH của đất từ 6-7 là thích hợp nhất [13].

Cây lạc được coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt và trong công nghiệp.