Luận án nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn bản địa Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Bùi Xuân Nguyên 2. Nguyễn Việt Linh Hà Nội, 2021 i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Xuân Nguyên, Nguyên Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học và TS.

Nguyễn Việt Linh, Phó Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hỗ trợ kĩ thuật và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn ơn các thầy cô giáo, các cán bộ Học viện Khoa học và Công nghệ đã chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu và hoàn thành các thủ tục liên quan đến luận án. Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc TS.

Nguyễn Thị Ước, Phòng công nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học đã chỉ bảo, hướng dẫn kĩ thuật và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu làm việc cho đến nay, sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Thị Ước đã góp một phần rất lớn không chỉ trong kết quả của luận án này mà còn trong suốt thời gian làm việc của tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhóm nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh học, tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến sỹ Tamas Somfai, nghiên cứu viên chính Phòng nghiên cứu sinh sản và chăn nuôi, Viện chăn nuôi và khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ Thị Kim Lành, Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản đã hướng dẫn kĩ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ tôi để thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn TS.

Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học cùng các cán bộ Phòng công nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học đã có những góp ý để tôi hoàn chỉnh luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh đã tận tình hướng dẫn ii tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh tại học viện. Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng con đã luôn hỗ trợ và tạo điểu kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm làm việc và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn. Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả NCS. Nguyễn Thị Nhung iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả NCS.

Nguyễn Thị Nhung iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN. i LỜI CAM ĐOAN ĐOAN. iii MỤC LỤC. iv DANH MỤC CÁC BẢNG.

vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ. viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn.

Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn. Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo. Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn. Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro.

Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục. Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi. Tạo phôi lợn bằng kĩ thuật NBVT. Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro.

Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản. Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt Nam. 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP. Vật liệu, hoá chất nghiên cứu.

Mẫu nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị. Thiết bị nghiên cứu.

Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản. Phương pháp nghiên cứu. Phân loại tháng theo mùa. Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng.

Phương pháp đo kích thước và khối lượng buồng trứng. Phương pháp phân chia nhóm nang. Phương pháp thu trứng. Phương pháp phân loại chất lượng trứng.

Phương pháp đo kích thước trứng lợn. Phương pháp nuôi trứng. Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi. Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh.

Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh. Phương pháp TTON. Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh. Phương pháp đông lạnh phôi.

Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn. Phương pháp nhân nuôi tế bào. Phương pháp đông lạnh tế bào. Phương pháp NBVT (NBVT).

Phương pháp nuôi phôi. Phương pháp nhuộm Hoechst. Phương pháp nhuộm Orcein. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu.

50 vi CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng 54 ở lợn Bản theo mùa. Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa. Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản.

Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng 59 lợn Bản. Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản. Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản. Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục 68 trứng lợn Bản.

Kết quả tạo phôi lợn Bản bằng TTON. Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản. Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát 84 triển phôi.

Đông lạnh phôi TTON. Kết quả nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT. Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Landrace.

Tạo nguồn tế bào cho nhân trong NBVT. Kết quả tạo phôi lợn Bản NBVT. 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 107 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN 109 ĐẾN ĐỀ TÀI.

TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3. Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa. Số lượng nang trung bình theo kích thước.

Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản…………………. Kích thước trứng lợn Bản (µm). Sự thành thục của trứng lợn Bản. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản.

Chất lượng tinh sau khi thu. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng.

Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản. Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh.

Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh. Kết quả đông lạnh phôi TTON. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi trường nuôi.

Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi trường nuôi .97 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú. Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân.

Quá trình thành thục của trứng lợn. Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng. Các giai đoạn phát triển của phôi lợn. Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10.

Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục của trứng động vật có vú.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic.1 Buồng đếm tinh trùng.2 Bố trí dầu trong kim.3 Đĩa môi trương thao tác loại nhân tế bào trứng.4 Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân.5 Đĩa môi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng.6 Xung điện trứng sau cấy nhân.1 Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: .2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa.3 Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C.4 Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn.5 Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng 64 ix A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa.6 Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống Nuôi IVM.7 Trứng lợn Bản sau nuôi thành thục trong các môi trường.8 Đông lạnh tinh dịch lợn Bản.9 Các giai đoạn phát triển của phôi sau thụ tinh.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn Landrace.11 Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi trong TCM-199+10% pFF và trong POM .12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT.