Nghiên cứu cấu trúc Ulvan hoạt tính sinh học từ Ulva lactuca và Ulva reticulata

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Quách Thị Minh Thu NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA ULVAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ ULVA RETICULATA LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Quách Thị Minh Thu NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA ULVAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ ULVA RETICULATA Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý Mã sỗ: 62.19 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.TS Thành Thị Thu Thủy 2.TS Trần Thị Thanh Vân Hà Nội - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Thành Thị Thu Thủy và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Quách Thị Minh Thu ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới tập thể cán bộ hướng dẫn khoa học PGS.TS Thành Thị Thu Thủy - Viện Hóa học và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hai PGS là những người Thầy đã chia sẻ kinh nghiệm, hướng dẫn tôi cách tiếp cận với lĩnh vực khoa học chuyên sâu mà tôi đang theo đuổi, cũng như các vấn đề khác trong cuộc sống trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Đặc biệt, tôi xin cảm ơn Trung tâm Các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về thời gian cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Yuguchi Yoshiaki– Trường Đại học Điện -Truyền thông Osaka đã giúp thực hiện phép đo SAXS và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành công việc trong thời gian thực tập tại Nhật Bản. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, các anh chị phụ trách Đào tạo sau Đại học - Viện Hóa học và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và những người thân luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

TÁC GIẢ LUẬN ÁN Quách Thị Minh Thu iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC HÌNH.

viii DANH MỤC BẢNG. Rong biển và sulfate polysaccharide từ rong biển. Phân loài rong biển. Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển.

Sulfate polysaccharide từ rong biển. Sulfate polysaccharide từ rong nâu. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ. Sulfate polysaccharide từ rong lục.

Rong lục chi Ulva và ulvan. Rong lục chi Ulva. Thành phần và cấu trúc hóa học của ulvan. Các tính chất hóa lý của ulvan.

Hoạt tính sinh học và ứng dụng của ulvan. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC. Phương pháp phổ hồng ngoại IR.

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR. Phương pháp phổ khối lượng MS. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án.

Tình hình nghiên cứu trong nước. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu. Phân tích thành phần hóa học của rong.

Chiết tách và tinh chế ulvan. Đánh giá hoạt tính sinh học. Xác định cấu trúc của ulvan. Phân tích thành phần hóa học của ulvan.

Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC). Phương pháp phổ hồng ngoại (IR). Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Phương pháp phổ khối lượng (MS).

Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM). Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Lựa chọn mẫu nghiên cứu. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan. Xác định cấu trúc của ulvan.

Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H). Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N). Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N). Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H).

Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh học của ulvan. Ảnh hưởng của sự sulfate hóa. Ảnh hưởng của sự acetyl hóa. 106 KẾT LUẬN CHUNG.

110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ. 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 131 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13 C- NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C resonance spectroscopy 1 H- NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H spectroscopy AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội hóa học phân tích Chemist COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H CS% Cell survival % % tế bào sống sót DA Degree of Acetyl Mức độ acetyl hóa DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DS Degree of Sulfation Mức độ sulfate hóa ESI -MS Electron spray ionization mass Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện spectrometry Gal Galactose Galactose GlcA Glucuronic acid Glucuronic acid GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel HeLa Henrietta lacks Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Dòng tế bào ung thư gan người HMBC Heteronuclear mutiple bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết connectivity HSQC Heteronuclear single-quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết coherence IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm IdoA Iduronic acid Iduronic acid IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại MALDI-MS Matrix assisted laser desorption Phổ khối lượng ion hóa khử hấp thụ nền ionization mass spectrometry laze Man Mannose Mannose MCF-7 Michigan cancer foundation-7 Dòng tế bào ung thư vú người MIC minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu Mn Number average molecular mass Khối lượng phân tử trung bình số Mw Weight average molecular mass Khối lượng phân tử trung bình khối NOESY Nuclear Overhauser effect Phổ tương tác không gian đồng hạt nhân 1H- 1 Spectroscopy H OD Optical density Mật độ quang học Rha Rhamnose Rhamnose SAXS Small Angle X-ray scattering Tán xạ tia X góc nhỏ SEM Scanning Electron Microscope Hiển vi điện tử quét vii SP Sulfate polysaccharide Sulfate polysaccharide UL-H Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca UL-K Ulvan chiết kiềm từ rong lục Ulva lactuca UL-N Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca UR-Ac Ulvan acetyl hóa từ UR-N UR-H Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata UR-K Ulvan chiết kiềm từ rong lục Ulva reticulata UR-N Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata UR-S Ulvan sulfate hóa từ UR-N UroA Uronic acid Uronic acid Xyl Xylose Xylose viii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình ảnh về một số loài rong nâu.

Hình ảnh về một số loài rong đỏ. Hình ảnh về một số loài rong lục. Biểu đồ biểu thị sự phân bố các loài rong lục có sulfate polysaccharide [38]. Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan [38].

Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua Ca2+: hoặc a) của borate ester hoặc một phần của b) carboxylate hoặc một phần của c) sulfate [1, 51]. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate [111]. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS.

Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa. Hình ảnh của mẫu rong nghiên cứu. Quy trình chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm tế bào sống sót.

56 vào nồng độ ulvan UL-N. Phổ IR của UR-H. Phổ 1H-NMR của UR-H. Phổ 13C-NMR của UR-H.

Phổ COSY của UR-H. Phổ HSQC của UR-H. Phổ HMBC của UR-H. Phổ ESI-MS của UR-H.

Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 419. Phổ IR của UR-N. Phổ 1H-NMR của UR-N.

Phổ 13C-NMR của UR-N. Phổ COSY của UR-N. Phổ HSQC của UR-N. Phổ HMBC của UR-N.

Phổ ESI-MS của UR-N. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaUroASO3]- tại m/z 419. Sơ đồ phá mảnh của UR-N.

Cấu trúc ulvan UR-N từ rong lục Ulva reticulata. Biểu đồ Kratky của dung dịch UR-N 1% trong nước. 78 và trong NaCl 0,5 M. Biểu đồ Guinier của dung dịch UR-N 1% trong nước.

79 và trong NaCl 0,5 M. a) Đơn vị cấu trúc để xây dựng mô hình cấu trúc phân tử, b) Mô hình cấu trúc phân tử của UR-N xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học. Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm và từ mô hình cấu trúc phân tử. Phổ IR của UL-N.

Phổ 1H-NMR của UL-N. Phổ 13C-NMR của UL-N. Phổ COSY của UL-N. Phổ HSQC của UL-N.

Phổ HMBC của UL-N. Phổ ESI-MS của ulvan UL-N. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243. Phổ 1H-NMR của UL-H.

Phổ 13C-NMR của UL-H. Phổ COSY của UL-H. Phổ HSQC của UL-H. Phổ HMBC của UL-H.

Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243. Phổ IR của UR-N (a) và UR-S (b). Phổ 13C-NMR của UR-N (a) và UR-S (b). Phổ HSQC của UR-N (a) và UR-S (b).

Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-S (b). Phổ 1H-NMR a) và 13C-NMR b) của UR-Ac. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-Ac (b). 107 x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.

Phân loài rong lục trên thế giới có sulfate polysaccharide [38]. Một số nhóm đặc trưng của phổ IR của polysaccharide từ rong biển. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose và galactose [104]. Thành phần hóa học của rong (% trọng lượng rong khô).

Kết quả hiệu suất chiết tách 6 mẫu ulvan. Kết quả phân tích thành phần hóa học của 6 ulvan. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 6 mẫu ulvan. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan.

Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan .