Luận án tiến sĩ phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Nguyễn Duy Phương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Nguyễn Duy Phương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.TS Phạm Xuân Hội 2. Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội – 2015 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phạm Xuân Hội và GS. Phan Tuấn Nghĩa.

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2016 Nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Phương TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp), GS.

Phan Tuấn Nghĩa (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) và TS. Narendra Tuteja (Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế, New Delhi, Ấn Độ) là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Phòng Sau Đại học (Trường ĐH KHTN) và Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về tất cả các thủ tục cần thiết trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật - Hóa sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng dạy trong suốt khóa học và tập thể cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN), nhóm nghiên cứu của TS.

Narendra Tuteja và các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi để hoàn thành luận án tốt nghiệp này. Tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đã cấp kinh phí nghiên cứu thông qua Đề tài mã số 106.69 và Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học Quốc tế (Italy) đã hỗ trợ về mặt tài chính và khoa học thông qua Chương trình học bổng “Sandwich PhD Fellowship”. Hà Nội ngày 20 tháng 02 năm 2016 Nguyễn Duy Phương TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.

4 DANH MỤC BẢNG. 7 DANH MỤC HÌNH. 10 Chƣơng 1: TỔNG QUAN. HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT.

Giới thiệu chung về hạn hán. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với thực vật. Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn.

Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật. ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN. Promoter cảm ứng với điều kiện hạn. Điều hòa hoạt động gen sau phiên mã.

Phân vùng mRNA trong tế bào chất. Điều hòa sau dịch mã. Vai trò điều hòa hoạt động gen của RNA không mã hóa. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG HẠN.

Nhân tố phiên mã AP2/ERF. Nhân tố phiên mã NAC. Nhân tố phiên mã WRKY. Một số nhân tố phiên mã khác.

38 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT. Nghiên cứu chuyển gen vào lúa. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn.

43 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tƣợng nghiên cứu. Chủng vi sinh vật. Vector và oligonucleotide.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Xử lý mẫu thực vật. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA. Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T.

Thiết kế vector biểu hiện gen OsNLI-IF. Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA. Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp. Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF.

68 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U & THẢO LUẬN. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở LÚA. Tổng hợp thƣ viện cDNA thứ cấp. Phân lập gen mã hoá nhân tố phiên mã bằng kỹ thuật Y1H.

Nhân dòng gen mã hóa protein OsNLI-IF. 77 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF. Biểu hiện của gen OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh học.

Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích của OsNLI-IF. Hoạt tính hoạt hóa quá trình phiên mã của OsNLI-IF. Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF.

Thiết kế hệ vector biểu hiện pCAMBIA1301. Thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN. Biến nạp vector biểu hiện vào A.

Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc lá. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây lúa chuyển gen. 133 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

147 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 3-AT 3-Amino-1, 2, 4-triazole A. thaliana Arabidopsis thaliana A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ABA Abscisic acid ABRE Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT (ACGT-containing abscisic acid response element) AD (acting domain) AMP Adenosine monophosphate ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate BAP 6-Benzylaminopurine BD (binding domain) BĐKH Biến đổi khí hậu bp Cặp bazơ (base pair) BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin) CBB Coomassie Brilliant Blue cDNA DNA ung (complementary deoxyribonucleic acid) Ct Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle) dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonate DMSO Dimethyl sulfoxide dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive element) DREB Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide HSP Protein sốc nhiệt (Heat shock protein) IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilobase LB Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani LEA Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của phôi (late embryogenesis abundant) LiAc Lithium acetate MCS đa điểm cắt (multiple cloning site) MOPS Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic mRNA Messenger ribonucleic acid MS Môi trƣờng nuôi cấy thực vật Murashige & Skoog MS-R Môi trƣờng MS nuôi cấy lúa MS-T Môi trƣờng MS nuôi cấy thuốc lá NAA 1-naphthaleneacetic acid NAC NAM/ATAF1/2/CUC2 NACRS Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition sequence) NLI-IF Nhân tố tƣơng tác với yếu tố tƣơng tác LIM trong nhân (nuclear LIM interactor-interacting factor) NST Nhiễm sắc thể OD Mật độ quang học (optical density) ORF Khung đọc mở (open reading frame) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com PEG Polyethylene glycol ROS Các dạ ng (reactive oxygen species) RT-PCR Phản ứng nhân bản DNA (reverse transcription polymerase chain reaction) S.

cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDM Môi trƣờng dinh dƣỡng tối thiểu (synthetic defined medium) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di gel polyacrylamide (SDS - Polyacrylamide gel electrophoresis) TAE Đệm Tris-acetate-EDTA TBE Đệm Tris-borate-EDTA TE Đệm Tris-EDTA TF Nhân tố phiên mã (transcription factor) Ti-plasmid Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid) -Trp/-Ura/Leu/-His/-Ade Môi trƣờng khuyết dƣỡng không có Triptophan/ Uracil/ Leucine/ Histidine/ Adenine X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Y1H Kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men dựa trên tƣơng tác DNA-protein (yeast one hybrid) Y2H Kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men dựa trên tƣơng tác protein-protein (yeast two hybrid) YEM Môi trƣờng nuôi cấy (yeast extract – manitol) YPD Môi trƣờng nuôi cấy nấm men destrose (yeast extract peptone dextrose) 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Gen mã hóa nhân tố phiên mã tăng cƣờng tính chịu hạn của lúa.1: Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu.2: Thành phần gel polyacrylamide chứa SDS.3: Thành phần môi trƣờng MS cơ bản.1: Kết quả sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y1H .2: Protein liên kết với đoạn DNA đích JRC0332 và JRC0528.3: Kết quả sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y2H .4: Protein tƣơng tác với OsNLI-IF sàng lọc từ thƣ viện cDNA .5: Tỉ lệ nảy mầm của dòng thuốc lá T1 trên môi trƣờng MS.6: Tỉ lệ nảy mầm của dòng thuốc lá T1 trên môi trƣờng có Hygromycin .7: Kết quả phân tích PCR các dòng thuốc lá T1.8: Tỉ lệ phục hồi sau xử lý stress hạn các dòng thuốc lá.9: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A.10: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T1 .11: Tỉ lệ cây lúa chuyển gen phục hồi sau xử lý hạn. 130 7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mạng lƣới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress.1: Mô hình thí nghiệm xử lý stress hạn cây chuyển gen.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF .3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF .1 và vector pAD-GAL4-2.5: Sơ đồ phƣơng pháp sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y1H.6: Sơ đồ phƣơng pháp sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y2H.1: Chuẩn hoá nồng độ thƣ viện cDNA thứ cấp .2: Kiểm tra thƣ viện cDNA thứ cấp bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc .3: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện trong nấm men .4: Nhân bản đoạn gen OsNLI-IF bằng kỹ thuật PCR .5: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF .6: Trình tự OsNLI-IF trong vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF.7: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện môi trƣờng bất lợi .8: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4 .9: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pAD/OsNLI-IF .10: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF trong nấm men.11: Ghép nối OsNLI-IF vào vector YEpGAP .12: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp YEpGAP/OsNLI-IF .13: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF trong nấm men .14: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pGBKT7 .15: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGBKT7/OsNLI-IF.16: Sơ đồ quá trình điều hòa hoạt động chức năng của OsNLI-IF .17: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pRT101 .18: PCR và cắt giới hạn pRT/OsNLI-IF-S và pRT/OsNLI-IF-AS .19: Ghép nối cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào pCAMBIA1301 .20: PCR và cắt giới hạn pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS.21: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pBI-Ubi và pBI-Lip9. 104 8 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.