Luận án tiến sĩ nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------- BÙI THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội-2006 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------- BÙI THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. Từ Minh Koóng 2. Phạm Văn Ty Hà Nội-2006 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lêi c¶m ¬n T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n §¹i häc Quèc gia Hµ néi, Tr-êng §H Khoa häc Tù nhiªn ®· ñng hé vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn vÒ c¸c thñ tôc, kinh phÝ ®Ó t«i hoµn thµnh nhiÖm vô cña mét nghiªn cøu sinh. T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c nhÊt ®Õn PGS.TS Tõ Minh Koãng, GS.

Ph¹m V¨n Ty nh÷ng ng-êi thÇy ®· tËn t×nh h-íng dÉn vµ gióp ®ì t«i ®Ó hoµn thµnh c«ng tr×nh nghiªn cøu nµy.TS KiÒu H÷u ¶nh, Chñ nhiÖm Bé m«n Vi sinh vËt häc, ng-êi ®· lu«n ñng hé vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi trong thêi gian t«i lµm viÖc vµ lµm luËn ¸n t¹i Bé m«n Vi sinh vËt häc, Tr-êng §H Khoa häc Tù nhiªn, §H Quèc gia Hµ néi. Hoµn thµnh b¶n luËn ¸n nµy, t«i còng ®· nhËn ®-îc nhiÒu sù gióp ®ì kh¸c: c¸c thÇy c¸c c« Bé m«n Vi sinh, Khoa Sinh häc, Tr-êng §H Khoa hoc Tù nhiªn ®· gióp ®ì vÒ thêi gian, ho¸ chÊt, thiÕt bÞ m¸y mãc cho c¸c thÝ nghiÖm cña luËn ¸n, c¶m ¬n TS. §ç Quyªn, Tr-êng §H D-îc Hµ néi ®· rÊt nhiÖt t×nh gióp t«i trong viÖc x¸c ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña chÊt kh¸ng sinh b»ng ph-¬ng ph¸p ph©n tÝch khèi phæ vµ céng h-ëng tõ h¹t nh©n. Nh©n dÞp nµy t«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi tÊt c¶ sù gióp ®ì quÝ b¸u ®ã.

LuËn ¸n nµy sÏ kh«ng thÓ hoµn thµnh nÕu t«i kh«ng nhËn ®-îc sù gióp ®ì vµ ñng hé lín lao tõ gia ®×nh, ng-êi th©n vµ nh÷ng ng-êi ®· lu«n ë bªn c¹nh t«i trong c¶ nh÷ng lóc thuËn lîi vµ khã kh¨n nhÊt ®Ó l¾ng nghe, ®éng viªn vµ chia sÎ. Hµ néi, ngµy 21 th¸ng 2 n¨m 2006 Bïi ThÞ ViÖt Hµ 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Hà nội, ngày 21 tháng 2 năm 2006 Tác giả Bùi Thị Việt Hà 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU.

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH.

Chất kháng sinh (Antibiotic). Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH .Ức chế tổng hợp thành tế bào. 19 Liên kết với protein thụ thể.

Ức chế sự tổng hợp protein. Chất kháng sinh phá huỷ màng sinh chất của tế bào .4 Ức chế các con đường trao đổi chất. Ức chế sự tổng hợp axit nucleic. XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN.

Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên. Những khái niệm cơ bản về xạ khuẩn. Streptomyces và xạ khuẩn hiếm.

PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN. Phân loại chi Streptomyces. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh.

Công nghệ lên men CKS – Quá trình sau lên men (Downstream Processing). Sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp CKS. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CHẤT KHÁNG SINH. Tách chiết CKS từ hệ khuẩn ty.

Tách chiết CKS từ dịch lọc. Tinh chế CKS. Đơn vị chất kháng sinh. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

CÁC BỆNH THỰC VẬT DO NẤM GÂY RA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP. Sự lan truyền và chu kỳ phát triển của nấm gây bệnh thực vật. Các loại nấm gây bệnh thực vật thường gặp. Thiệt hại về kinh tế do vi nấm gây ra đối với nông nghiệp.

51 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Sơ lược về tình hình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng sinh trong phòng chống các bệnh do vi sinh vật gây ra ở thực vật trên thế giới và ở Việt Nam. Các chất kháng sinh được sử dụng phòng trừ nấm gây hại thực vật. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật.

Ứng dụng xạ khuẩn và các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT. Dụng cụ và thiết bị.

Các công thức môi trường. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp thu mẫu bệnh thực vật, phân lập nấm và định tên. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn.

Bảo quản giống. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn. Các phương pháp sinh học phân tử. Lên men tạo kháng sinh.

Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh. Xác định một số tính chất của chất kháng sinh. Sản xuất chế phẩm bào tử xạ khuẩn. Tìm hiểu khả năng ứng dụng.

Thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng [10]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN. Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn.

Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN. Đặc điểm hình thái. Đặc điểm nuôi cấy.

Đặc điểm sinh lý – sinh hoá. Hoạt tính kháng sinh. Giải trình tự ADNr 16S của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu. 100 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CKS CỦA 3 CHỦNG XẠ KHUẨN ĐÃ LỰA CHỌN. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng hình thành CKS của 3 chủng T-41, D-42 và TC-54 .1 Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ. Động học của quá trình lên men của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu.

Tối ưu hoá môi trường lên men chủng TC-54 – Phương pháp Box- Willson. Lên men xốp chủng T-41. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CKS TC-54. Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ.

Xác định khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh. Xác định Rf của chất kháng sinh. 120 CHẤT KHÁNG SINH. 121 HỆ DUNG MÔI.

Tách chiết CKS TC-54 bằng chất hấp phụ. Tách chiết CKS TC-54 bằng nhựa trao đổi ion. Nhận dạng CKS TC-54. Mối tương quan giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn.

Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC). TÌM HIỂU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÁC CKS THÔ T-41, D-42 VÀ TC-54 .1 Ảnh hưởng của CKS trong dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn T-41 và TC-54 tới khả năng nảy mầm của hạt. Ảnh hưởng của CKS T-4l và TC-54 đến khả năng sinh trưởng của cây. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM.

Quy trình sản xuất chế phẩm T-41 và D-42. Xác định một số tính chất của chế phẩm T-41 và D-42. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng. 141 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO.

142 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 143 7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ BVTV Bảo vệ thực vật CFU (colony forming unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc CKS Chất kháng sinh CMC (carboxymethyl cellulose) carboxymethyl xenluloza CZ (Czapek–Dox–Agar) Môi trường Czapeck Dox DAP (diamino acid pymelic) Axit diamino pimelic (DHF), dihidrofolic axit đihidrofolic dNTP (deoxyribonucleotide Các loại nucleotit gồm:dATP, dCTP, triphosphate)Deoxyribo dGTP and dTTP dùng trong phản ứng PCR (PABA) para-aminobenzoic acid Axit para-aminobenzoic EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid) Axit etylen diamin tetra axetic FDA (Food and Drug Administration) Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ G (-) (+) Vi khuẩn Gram âm, dương HPLC ( High performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng cao áp IR (Infrared) spectroscopy Phổ hồng ngoại ISP ( International Streptomyces Project) Chương trình xạ khuẩn quốc tế IU/ml Đơn vị quốc tế/ml KTCC Khuẩn ty cơ chất KTKS Khuẩn ty khí sinh LD50 (lethal dose) Liều gây chết 50 % MIC (Minimum inhibition concentration) Nồng độ ức chế tối thiểu MS ( mass spectrophotometry) Khối phổ MW (Molecular Weight) Trọng lượng phân tử NAG (N-acetylglucozamine) N-acetylglucozamin NAM (N-acetylmuramic) N-acetylmuramic 8 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com NMR ( nuclear magnetic resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PCR (Polymerase chain reaction) Phản ứng chuỗi polime PDA (Potato Dextrose Agar) Môi trường thạch khoai tây PG (peptidoglycan) Thành tế bào vi khuẩn RA (Retinaculiaperti) Cuống sinh bào tử hình móc câu RF (Rectiflexibiles) Cuống sinh bào tử hơi lượn sóng S (Spirales) Cuống sinh bào tử dạng xoắn SDS ( sodium docecyl sulfate) Natri docecyl sulphat TLC (thin layer chromatography) Sắc ký bản mỏng TLm ( Median Tolerance limit) Giới hạn chịu đựng trung bình THF (tetrahydrofolic) axit tetrahydrofolic U (Unit) Đơn vị UDP-GlcNAc (Uridine Diphosphate -N- Uridin Diphotphat-N- acetylglucosamine) acetylglucosamin VSV Vi sinh vật 9 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes 15 Bảng 3. Số lượng và sự phân bố xạ khuẩn trong đất ở một số vùng 73 Bảng3.

Đặc điểm nuôi cây của 3 chủng 78 Bảng 3. Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng T-41, D-42 và TC-54 79 Bảng 3. Khả năng đồng hoá đường của các chủng T-41, D-42 và TC-54 80 Bảng 3. Hoạt phổ kháng khuẩn của 3 chủng xạ khuẩn 81 Bảng 3.

So sánh đặc điểm phân loại của chủng T-41 với loài chuẩn S. 87 antimycoticus và chủng D-42 với loài chuẩn S. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn TC-54 với chủng 88 chuẩn S. hygroscopicus ISP – 5578 Bảng 3.

Hoạt tính kháng F. oxysporum của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 93 trên các môi trường lên men khác nhau Bảng 3. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp 95 CKS của các chủng T-41, D-42 và TC-54 Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành chất kháng 96 sinh của 3 chủng xạ khuẩn Bảng 3.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh 97 tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và TC- 54 Bảng 3.