Luận án tiến sĩ nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nền đáy vùng nuôi tôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ TRONG NỀN ĐÁY VÙNG NUÔI TÔM HÙM (Panulirus sp.) PHỤC VỤ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP. HCM - Năm 2022 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ TRONG NỀN ĐÁY VÙNG NUÔI TÔM HÙM (Panulirus sp.) PHỤC VỤ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Phú Hòa PGS. Phạm Công Hoạt TP.HCM - Năm 2022 ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của tập thể Quý Thầy Cô, các cơ quan, các anh chị và các bạn.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến: PSG.TS Nguyễn Phú Hòa và PGS.TS Phạm Công Hoạt đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm và kiến thức quý báo giúp tôi hoàn thành tốt luận án. Hoàng Quốc Khánh, PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc đã động viên, hỗ trợ nhiệt tình về chuyên môn. Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Khoa Khoa học Sinh học, Khoa Thủy Sản, Phòng Đào tạo Sau Đại học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tập thể các bạn nghiên cứu viên, học viên cao học, sinh viên từ phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM đã hỗ trợ, giúp đỡ để tôi học tập, thực hiện và hoàn thành tốt luận án.

Tất cả bạn bè và đồng nghiệp những người luôn động viên, giúp đỡ chân thành tôi trong quá trình làm luận án. Ba Mẹ và những người thân trong gia đình, chồng và các con đã luôn ủng hộ, động viên và là điểm tựa tinh thần cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Nghiên cứu sinh Trương Phước Thiên Hoàng iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và một phần kết quả nghiên cứu thuộc đề tài cấp nhà nước mã số ĐTĐL.CN-60/15 do PGS. Nguyễn Phú Hòa làm chủ nhiệm.

Những số liệu trong luận văn được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài. Tất cả các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là chưa từng được công bố trong thời gian trước đây bởi tác giả khác. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG iv TÓM TẮT Nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nền đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp.) phục vụ nuôi trồng thủy sản được thực hiện với các nội dung sau: (1) Nghiên cứu đã tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn từ các mẫu bùn được lấy từ nền đáy dưới các lồng bè nuôi tôm hùm ở vùng Vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên trong thời gian 12 tháng; (2) Nghiên cứu tạo môi trường lên men dạng lỏng và dạng bán rắn phù hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng tạo chế phẩm sinh học xử lý môi trường; (3) Đánh giá chế phẩm vi sinh xử lý môi trường trong mô hình ương tôm thẻ chân trắng giai đoạn post 5 ở qui mô 1m3. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonia và nitrite.

Các chủng vi khuẩn được định danh bằng phương pháp kiểm tra đặc điểm hình thái, sinh hóa bằng kit API 20E, 20NE, phương pháp giải trình tự vùng 16S – rRNA và xác định khả năng chuyển hóa ammonia và nitrite; trong đó có 3 chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, Rhodococcus rhodochrous T9 có khả năng chuyển hóa ammonia, nitrite tốt nhất. Luận án đã nghiên cứu được thành phần môi trường dạng lỏng phù hợp cho sự phát triển của 3 chủng vi khuẩn trên mô hình Box – Behnken như sau: thành phần môi trường cho vi khuẩn B.licheniformis B85 ở mật số 3,14 x 1011 CFU/mL bao gồm 3,94 g/L mật rỉ đường, 15,56 g/L cao nấm men và 1,13 g/L NaCl; Mật độ vi khuẩn P.stutzeri KL15 là 2,37 x 1011 CFU/mL với thành phần môi trường gồm 4,95 g/L mật rỉ đường, 19,08 g/L cao nấm men và 1,13 g/L MgSO4; Đối với chủng vi khuẩn R.rhodochrous T9, thành phần môi trường là 7,93 g/L glucose, 6,1 g/L pepton và 2,95 g/L NaCl với mật số vi khuẩn là 2,52 x 1010 CFU/mL. Ba chủng vi khuẩn trên được nuôi cấy trên môi trường bán rắn với tỷ lệ giống, thời gian và độ ẩm thích hợp, sau đó được sấy và nghiền mịn để tạo chế phẩm vi sinh dạng bột với mật số vi khuẩn 109 CFU/g. Chế phẩm vi sinh dạng bột được bảo quản ở hai khoảng nhiệt độ: nhiệt độ lạnh 4 - 8oC và nhiệt độ phòng 28-32oC.

Ở v nhiệt độ 4 - 8oC, mật số vi khuẩn được bảo quản tốt hơn, sau 360 ngày thì mật độ vi khuẩn P.rhodochrous T9 có giảm từ 109 CFU/g còn 106 CFU/g, vi khuẩn B.licheniformis B85 giảm từ 109 CFU/g còn 107 CFU/g. Đối với bảo quản ở nhiệt độ phòng 28-32o C, sau 360 ngày, mật độ vi khuẩn P. stutzeri KL15 và R.rhodochrous T9 có giảm từ 109 CFU/g còn 105 CFU/g, mật số vi khuẩn B. licheniformics B85 giảm từ 109 CFU/g còn 106 CFU/g.

licheniformics B85 là nhóm vi khuẩn sinh bào tử nên có mật độ vi khuẩn cao hơn so với 2 chủng vi khuẩn còn lại. Kết quả đánh giá hiệu quả xử lý môi trường của chế phẩm vi sinh trên mô hình ương giống tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn postlarvae 5 trong bể xi măng 1m3 cho thấy khả năng kiểm soát tốt hàm lượng TAN, NO2 và NO3 với tỷ lệ chế phẩm là 0,5% với mật độ 108 CFU/g, sử dụng định kỳ 6 ngày/1 lần. vi SUMMARY The study on nitrogen-metabolizing bacteria in the bottom of lobster (Panulirus sp.) culture area for aquaculture was carried out with the following contents: (1) The study was conducted to isolate and identify bacteria from sludge samples which were taken from the bottom of lobster cages in Xuan Dai Bay, Phu Yen province during 12 months (2) Research on create suitable liquid and semi- solid media for bacterial strains to make biological products to treat the environment; (3) Experimenting with the use of microbiological products for environmental treatment in the 5-day old postlarvae of white leg shrimp rearing in 1m3 - cement tanks. The results shown that bacterial strains capable of metabolizing ammonia and nitrite in the bottom sludge, strains were identified by morphological, biochemical and DNA marker characterization by API 20E, 20NE kit and 16S - rRNA region sequencing method and determined the ability to metabolize ammonia, nitrite.

Three strains of Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, and Rhodococcus rhodochrous T9 were able to metabolize ammonia and nitrite in highest efficience. The thesis has optimized the composition of liquid medium of 3 bacterial strains on the Box - Behnken model as follows: the composition of the medium of Bacillus licheniformis B85 at the density of 3,14 x 1011 CFU/mL includes molasses, yeast extract and NaCl. The density of Pseudomonas stutzeri KL15 was 2,37 x 1011 CFU/mL with the media composition including molasses, yeast extract and MgSO4. For the strain Rhodococcus rhodochrous T9, the media composition was glucose, peptone and NaCl with a bacterial density of 2,52 x 1010 CFU/mL.

The above three bacterial strains were cultured on semi-solid media with suitable time and humidity, then dried and ground to produce a powdered probiotic product with a bacterial density of 109 CFU/gram. Powder microbiology mode is stored at two temperature ranges: cold temperature 4-8oC and room temperature 28- 32oC. At a temperature of 4 - 8oC, the bacterial density was better preserved, after vii 360 days, the density of P.rhodochrous T9 decreased from 109 CFU/g to 106 CFU/g, B.licheniformis B85 reduced from 109 CFU/g to 107 CFU/g. For storage at temperature 28-32oC, after 360 days, the density of P.stutzeri KL15 and R.rhodochrous T9 decreased from 109 CFU/g to 105 CFU/g, the density of B.licheniformics B85 reduced from 109 CFU/g to 106 CFU/g.

licheniformics B85 is a group of spore-forming bacteria, so it has a higher concentration of bacteria than P.stutzeri KL15 and R. The results of evaluation of the environmental treatment efficiency of probiotic products in water of the white leg shrimp nursing cement tank showed the ability to control the content of TAN, NO2 and NO3 well with a density of 108 CFU/g, used periodically every 6 days. viii MỤC LỤC Trang tựa .ii Lời cam đoan. vi Mục lục.

viii Danh sách chữ viết tắt. xiv Danh sách các bảng. xv Danh sách các hình.xvii MỞ ĐẦU. 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Tổng quan tình hình nuôi tôm hùm lồng bè. Hiện trạng ô nhiễm môi trường nước vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài. Vi sinh vật trong môi trường nước mặn. Sơ đồ chu trình chuyển hóa nitơ trong hệ sinh thái biển.

Các quá trình chuyển hoá nitơ và vai trò các nhóm vi khuẩn tham gia chuyển hóa. Đặc điểm của các nhóm vi khuẩn tham gia quá trình chuyển hóa Nitơ. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Rhodococcus.

Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Pseudomonas. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Stenotrophomonas. Đặc điểm sinh học của các nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitơ khác. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn.

Nguồn khoáng và vitamin. Thời gian nuôi cấy. Động học của quá trình vi sinh vật. Sơ lược về ma trận Plackett - Burman và Box - Behnken.

Giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM). Ma trận Plackett - Burman. Ma trận Box-Behnken (BBD). Các yếu tố ảnh hưởng đến môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng.

Ammonia tổng cộng (TAN - Total Ammonia Nitrogen). Nitrite và Nitrate. Tình hình nghiên cứu ứng dụng của vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản. Tình hình ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản trong nước.

Tình hình ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới .24 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Phương pháp thu mẫu bùn đáy. Vị trí thu mẫu.

Phương pháp phân tích hóa lý của mẫu bùn:. Nội dung 1: Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa Nitơ từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus sp. Phân lập vi khuẩn Bacillus sp.

Phương pháp định danh sinh hóa vi khuẩn Bacillus sp. Phương pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn Bacillus sp. Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB). Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonia (phụ lục 1.