Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân tích đánh giá hàm lượng kháng sinh họ betalactam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------*-------------- NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG KHÁNG SINH HỌ BETALACTAM TRONG ĐỐI TƢỢNG DƢỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2013 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG KHÁNG SINH HỌ BETALACTAM TRONG ĐỐI TƢỢNG DƢỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI CHUYÊN NGÀNH : HÓA PHÂN TÍCH MÃ SỐ : 62 44 29 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PHẠM HÙNG VIỆT HÀ NỘI – 2013 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và nội dung này chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trƣớc đó. Hà Nội, tháng 2 năm 2013 Tác giả luận án Nguyễn Thị Ánh Tuyết TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.

NGUYỄN VĂN RI và GS. PHẠM HÙNG VIỆT đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô, các anh chị cán bộ trong Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Trung tâm nghiên cứu công nghệ môi trƣờng và phát triển bền vững - Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ nghiên cứu, Ban Lãnh đạo Viện Khoa học công nghệ môi trƣờng (INEST) đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Cơ bản, Trƣờng Đại học Y- Dƣợc Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc học tập và hoàn thành bản luận án. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ, anh chị, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp những ngƣời luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Hà Nội, tháng 2 năm 2013 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ánh Tuyết TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC .iii KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN. vi KÝ HIỆU ĐƠN VỊ ĐO LƢỜNG CÁC ĐƠN VỊ ĐO LƢỜNG.

viii DANH MỤC CÁC BẢNG. ix DANH MỤC CÁC HÌNH. xii MỞ ĐẦU. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Giới thiệu chung về chất kháng sinh β- lactam .1 Tính chất vật lý và hoá học.3 Tính chất quang học của các β- lactam .2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay .3 Một số phƣơng pháp định lƣợng β- lactam .1 Phƣơng pháp quang học .2 Phƣơng pháp điện hóa .3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .4 Phƣơng pháp điện di mao quản- electrophoresis (CE).

19 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Mục tiêu nghiên cứu.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .1 Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).1 Phƣơng pháp RP - HPLC, detector UV .2 Phƣơng pháp RP - HPLC, detector huỳnh quang .3 Ứng dụng phƣơng pháp RP - HPLC, detector huỳnh quang để phân tích mẫu. 34 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu phân tích .2 Kỹ thuật điện di mao quản (CE).3 Hóa chất, mẫu phân tích và thiết bị, dụng cụ .2 Mẫu phân tích .3 Thiết bị và dụng cụ. 54 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.1 Tách và xác định đồng thời kháng sinh -lactam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .1 Kỹ thuật RP - HPLC, detector UV .1 Chọn các thông số máy đo để phát hiện chất phân tích .2 Hệ dung môi pha động .3 Đánh giá thống kê phƣơng pháp phân tích - lactam bằng phƣơng pháp RP-HPLC .4 Phân tích mẫu .2 Kỹ thuật RP- HPLC, detector huỳnh quang.1 Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa  - lactam và thuốc thử NBD-F .2 Tối ƣu hóa các điều kiện tách và định lƣợng một số kháng sinh họ  - lactam .3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích .4 Phân tích mẫu .3 Kết luận về phƣơng pháp HPLC .2 Tách và xác định đồng thời kháng sinh β- lactam bằng kỹ thuật điện di mao quản điện động học kiểu mixen (MEKC) .1 Chọn các thông số máy điện di .2 Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch điện giải đến quá trình điện di. 96 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.1 Ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm .2 Ảnh hƣởng pH của dung dịch đệm điện di .3 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất mixen SDS .4 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm .3 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu .4 Khảo sát ảnh hƣởng thế điện di .5 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ của mao quản .6 Đánh giá thống kê phƣơng pháp phân tích -lactam bằng MEKC .1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn .3 Độ lặp lại của phép đo .4 Giới hạn pháp hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp CE .7 Phân tích mẫu .1 Phân tích mẫu dƣợc phẩm .2 Phân tích mẫu nƣớc tiểu .8 Kết luận về phƣơng pháp điện di (CE) .3 So sánh kết quả phân tích của các phƣơng pháp MEKC, HPLC- UV, HPLC- huỳnh quang.

130 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 141 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN 6APA : Axit 6-amino penicillanic 7ACA : Axit 7-amino cephalosporinic β- lactam : Betalactam ACN : Acetonitril AMO : Amoxicillin AMP : Ampicillin C : Nồng độ CE : Điện di mao quản (Capillary electrophoresis) CEC : Cefaclor CEF : Cefixim CEP : Cephalexin CLO : Cloxacillin CZE : Điện di mao quản vùng (Capillary zone electrophoresis) EFF : Lực điện trƣờng E nhất định (Electric Field Force) Em : Bƣớc sóng phát xạ huỳnh quang EOF : Dòng điện di thẩm thấu  Ex : Bƣớc sóng kích thích huỳnh quang Gram (-) : Gram âm (vi khuẩn) Gram (+) : Gram dƣơng (vi khuẩn) HLB : Chất hấp phụ (hydrophilic lipophilic balance) Hpíc : Chiều cao píc sắc kí HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography) HPLC-MS : Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ MAX : Giá trị cao nhất TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MEKC : Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen- MEKC (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography) MeOH : Metanol MIN : Giá trị thấp nhất MP : Pha động (mobile phase) MS : Phổ khối (mass spectrometry) LOD : Giới hạn phát hiện (limit of detection) LOQ : Giới hạn định lƣợng (limit of quantily) NBD-F : 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole OXA : Oxacillin PENG : Penicillin G : Sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo RP- HPLC (Reversed phase- High performance liquid chromatography) rpm : Vòng / phút RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối SDS : Natri dodecyl sunfat SP : Pha tĩnh (static phase) SPE : Chiết pha rắn (solid phase extraction) Spic : Diện tích píc sắc kí TCA : Axit tricloaxetic UV : Tia cực tím (ultra violet) v/v : Thể tích /thể tích TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com KÝ HIỆU CÁC ĐƠN VỊ ĐO LƢỜNG ĐƢỢC VIẾT TẮT % : Phần trăm µg : Microgam µm : Micromet Cal : Calo cm : Centimet cm2 : Centimet vuông h : Giờ kg : Kilogam kV : Kilovôn mAu : Đơn vị hấp thụ mbar : Đơn vị áp suất mg : Miligam ml : Mililit mM : Milimol ng : Nanogam s : Giây TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin.

Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu. Các điều kiện tách và xác định  - lactam. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tách các β- lactam bằng CE. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.

Thông tin mẫu thuốc phân tích. Sự phụ thuộc k’ vào pH của pha động chạy sắc ký. Sự phụ thuộc của k’ vào thành phần pha động chạy sắc kí. Thời gian lƣu (phút) và diện tích píc (mAu.s) của các chất phụ thuộc vào nồng độ đệm.

Tóm tắt các điều kiện thực nghiệm tối ƣu để tách các β- lactam. Sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ chất phân tích. LOD và LOQ của phƣơng pháp HPLC-UV Vis. Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích HPLC/UV (0,15 µg/ml).

Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích HPLC/UV (0,40 µg/ml). Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích HPLC/UV (0,80 µg/ml). Độ lặp lại của phép đo ở các nồng độ chất phân tích khác nhau. Kết quả tính hàm lƣợng kháng sinh trong mẫu dƣợc phẩm.

Hiệu suất thu hồi của mẫu nƣớc tiểu. Sự phụ thuộc của Spíc vào nhiệt độ phản ứng. Sự phụ thuộc của Spíc vào lƣợng dƣ thuốc thử. Sự phụ thuộc của thời gian lƣu và hệ số tách của các chất vào pH pha động.

Sự phụ thuộc của thời gian lƣu vào tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ và đệm. 79 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Thời gian lƣu và diện tích píc của các chất phụ thuộc vào nồng độ đệm. Thời gian lƣu và diện tích píc của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động.

Sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ chất phân tích. Các giá trị Ftính, Fbảng và phƣơng trình đƣờng chuẩn của các kháng sinh β- lactam. Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích tại nồng độ các chất 0,15 µg/ml. Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích tại nồng độ các chất 0,40 µg/ml.

Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích tại nồng độ các chất 0,80 µg/ml. Độ lặp lại của phép đo ở các nồng độ chất phân tích khác nhau. Thông tin mẫu thuốc phân tích. Kết quả độ thu hồi xác định β-lactam theo phƣơng pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc.

Kết quả phân tích các β- lactam trong mẫu nƣớc tiểu. Hiệu suất thu hồi của CEP, CEC và AMP trong mẫu huyết thanh. Ảnh hƣởng của pH đến thời gian di chuyển của β-lactam. Ảnh hƣởng nồng độ SDS đến thời gian lƣu của β-lactam.

Ảnh hƣởng của nồng độ đệm tới thời gian lƣu (phút). Ảnh hƣởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lƣu (phút). Ảnh hƣởng của thế điện di tới thời gian lƣu (phút) .