Luận án tiến sĩ nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO THỊ THANH XUÂN NGHIÊN CỨU CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đào Thị Thanh Xuân NGHIÊN CỨU CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. LÊ THANH HÀ 2. PHÍ QUYẾT TIẾN Hà Nội – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận án này là trung thực và chưa được các tác giả khác công bố. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành Luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong Luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Đào Thị Thanh Xuân Tập thể GVHD 1.TS Lê Thanh Hà 2.TS Phí Quyết Tiến LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy giáo hướng dẫn khoa học là PGS. TS Lê Thanh Hà và PGS. Phí Quyết Tiến đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm -Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cũng như bạn bè, đồng nghiệp tại bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Viện Công nghệ Hóa Sinh và Môi trường, Trường Đại học Vinh đã hết sức giúp đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã hỗ trợ tôi trong các kết quả nghiên cứu về phân tích gen Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, em trong phòng Đào tạo Sau đại học của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần và giúp đỡ trong công việc tại phòng để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm thực hành thí nghiệm - Trường đại học Vinh, Phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội cùng các em sinh viên đã giúp đỡ tôi trong các nghiên cứu của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những người bạn đã động viên và khích lệ cho tôi có được sự chuyên tâm và động lực phấn đấu thực hiện luận án này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Đào Thị Thanh Xuân DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt tƣơng đƣơng BgIB Beta-glucosidase B Beta-glucosidase B BgIF Beta-glucosidase F Beta-glucosidase F BgIG Beta-glucosidase G Beta-glucosidase G Blast Basic Local Alignment Search Tool Công cụ so sánh mức tương đồng về trình tự nucleotide/axit amin Bp Base pair Cặp base BSA Bovine serum Albumin Albumin huyết thanh bò CBD Carbohydrate binding domain Vùng liên kết carbohydrate CD Catalytic domain Vùng xúc tác cDNA Complementary DNA DNA được tổng hợp từ khuôn mRNA nhờ enzym phiên mã ngược Cel12A Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 12 family 12 Cel45A Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 45 family 45 Cel48A Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 48 family 48 Cel5A Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 5A family 5 CBHI Cellobiohydrolase I Cellobiohydrolase thuộc họ I CBHII Cellobiohydrolase II Cellobiohydrolase thuộc họ II CMC Carboxymetyl cellulose Cơ chất Carboxymetyl cellulose COG/KOG Clusters/Eukaryotic of Orthologous Cơ sở dữ liệu protein của Group VSV nhân sơ/nhân chuẩn dCTP 2´-deoxycytidine 5´-triphosphate 2´-deoxycytidine 5´- triphosphate dATP 2´-deoxyadenosine 5´-triphosphate 2´-deoxyadenosine 5´- triphosphate dGTP 2´-deoxyguanosine 5´-triphosphate 2´-deoxyguanosine 5´- triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamin tetra acetic acid Axit Ethylene diamin tetra acetic Tween 80 Polysorbate 80 CAZy Carbohydrate Active Enzyme BGs β- glucosidase EG Endoglucanase FPU Filter paper αA α- Amylase GHs Glycoside hydrolase PLs Polysaccharide lyase CEs Carbohydrate esterase AAs Enzym hoạt hóa bổ trợ GT Glycosyl transferase MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU .Phân loại cellulase. Nguồn thu nhận cellulase. Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy .2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng.

Đặc tính của enzyme cellulase từ vi khuẩn. pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzym. Ảnh hưởng của các ion kim loại và các chất phụ gia đến hoạt độ enzym. Tổng quan về mối.

Phân loại Mối. Hệ vi sinh vật trong ruột mối .3 Vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối. Ứng dụng của cellulase trong xử lý lignocellulose. Thành phần của lignocelluloses.

Hệ enzym phân giải Lignocellulose. Sự phối hợp tác động giữa các enzym. Ứng dụng cellulase trong quá trình thủy phân lignocellulose. Ứng dụng giải trình tự genome phát hiện tiềm năng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase trong phân giải lignocellulose.

26 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP. Các chủng vi khuẩn. Thiết bị và hóa chất. Các môi trường nuôi cấy.

Môi trường làm giàu vi khuẩn sinh cellulase. Môi trường giữ giống, nhân giống và phân lập. Môi trường sinh tổng hợp enzym. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng sinh tổng hợp cellulase. Phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối. Xác định định tính khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập. Xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn sinh cellulase.

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp cellulase. Lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng vi khuẩn tuyển chọn. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến sinh tổng hợp enzym. Ảnh hưởng của thời gian thu nhận.

Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm tối ưu môi trường sinh tổng hợp CMCase cho Bacillus subtilis G4 sử dụng phần mềm Design Expert 7. Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Bacillus subtilis G4. Thu nhân chế phẩm cellulase từ vi khuẩn.

Đặc tính của chế phẩm cellulase thu nhận. Khảo sát khả năng thủy phân rơm sử dụng cellulase thu nhận từ vi khuẩn. Phương pháp tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất đường hóa lignocellulose của rơm sử dụng cellulase từ Cellulosimicrobium cellulans MP1.

Phương pháp định tên vi khuẩn thông qua giải trình tự 16S rDNA. Phương pháp giải trình tự hệ genom của Cellulosimicrobium cellulans MP1 và dự đoán gen chức năng. Tách chiết DNA hệ gen của vi khuẩn .2 Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina. Lắp ráp de novo hệ gen và đánh giá chất lượng lắp ráp.

Dự đoán gen và chú giải hệ gen. Các phương pháp phân tich. Xác định hoạt độ các enzym. Xác định hàm lượng protein.

Xác định độ ẩm nguyên liệu. Xác định hàm lượng cellulose. Xác định hàm lượng lignin. Phương pháp xác định lượng đường trong mẫu thủy phân bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao 47 3. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng lựa chọn. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa.

Định tên các vi khuẩn ruột mối. Nghiên cứu thu nhận cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis G4. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase .2 Ảnh hưởng của các thông số lên men đến hoạt độ CMCase.

Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase. Thu nhận cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 và xác định đặc tính của chế phẩm……. Thu nhận chế phẩm cellulase kỹ thuật từ B.

Đặc tính của chế phẩm cellulase từ vi khuẩn B. Khảo sát khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn G4 đối với các vật liệu giàu cellulose. Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn Cellulosimicrobium MP1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ MP1.

Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật nuôi cấy tới sinh tổng hợp CMCase từ vi khuẩn MP1. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp CMCase. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ.

Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon. Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusae. Xác đl "_Toc77151043" ợng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusaeC. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol.

Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp. So sánh giữa B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của chủng C.

Trình tự gen và một số đặc điểm khái quát của chủng C. Các cụm gen và chức năng gen của chủng MP1. So sánh COG toàn bộ genome và các enzyme liên quan đến chuyển hóa carbonhydrate. Khai thác các enzyme thủy phân sinh khối thực vật từ nguồn gen của chủng C.

Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của rơm sử dụng cellulase thu nhận từ MP1…. Xác định thành phần nguyên liệu rơm. Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất quá trình thủy phân. Ảnh hưởng các yếu tố tới hiệu suất thủy phân bởi enzym.

89 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 90 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN. 90100 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Đặc tính enzym cellulase và Xylanase từ C.2 Tính bền nhiệt của cellulase và xylanase từ C.3 Tính bền pH của cellulose và xylanase từ C. Tổng kết một số loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase đã được phân lập từ ruột các loài mối.

Thông tin các mẫu mối. Giá trị mã hóa và thực nghiệm Design-Expert 7. Thống kê kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối .2 Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các môi trường làm giàu .3 Các chủng có tỷ lệ (D/d) cao được chọn lựa .4 Hoạt độ cellulase và xylanase của các chủng vi khuẩn lựa chọn. Đặc điểm hình thái, sinh lý của 11 chủng vi khuẩn tuyển chọn .6 Kết quả định tên các chủng vi khuẩn lựa chọn từ ruột mối .7 Phân tích hồi quy (ANOVA) kết quả thí nghiệm .8 Kết tủa cellulase bằng ammonium sulfate bão hòa .9 Kết tủa cellulase bằng acetone .