Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu tạo laccase tái tổ hợp và thử nghi

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẶNG THỊ THANH HÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO LACCASE TÁI TỔ HỢP VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHỬ MÀU MỘT SỐ THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP Huế, năm 2022 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẶNG THỊ THANH HÀ NGHIÊN CỨU TẠO LACCASE TÁI TỔ HỢP VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHỬ MÀU MỘT SỐ THUỐC NHUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học 1. Phạm Thị Ngọc Lan 2. Nguyễn Đức Huy Huế, năm 2022 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. iv LỜI CẢM ƠN .v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.

vi DANH MỤC BẢNG. ix DANH MỤC HÌNH. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu chung về laccase.

Cấu tạo của laccase. Cơ chế xúc tác của laccase. Đặc tính của laccase. Các nguồn thu nhận laccase.

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase. Ứng dụng của laccase. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Pichia pastoris. Giới thiệu chung về hệ thống P.

Ưu, nhược điểm của P. pastoris so với các hệ thống biểu hiện khác. Hệ thống biểu hiện tái tổ hợp tương đồng sử dụng P. THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ.

Thuốc nhuộm công nghiệp. Các phương pháp xử lý thuốc nhuộm công nghiệp. Xử lý màu thuốc nhuộm bằng laccase. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Thu thập mẫu. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính laccase.

Khảo sát sinh tổng hợp laccase từ các chủng phân lập. Xác định hoạt độ enzyme laccase. Phương pháp xác định protein ngoại bào. Xác định một số đặc tính của laccase thô từ chủng phân lập.

Định danh phân tử chủng nấm phân lập. Phân lập các gen mã hóa laccase. Biểu hiện cFolac1 trong Pichia pastoris. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện laccase tái tổ hợp.

Tinh sạch enzyme tái tổ hợp. Điện di SDS – PAGE. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ laccase tái tổ hợp. Thử nghiệm khả năng khử màu thuốc nhuộm tổng hợp.

Xử lý thống kê. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH LACCASE. Phân lập, làm thuần và giữ giống các chủng nấm mốc.

Sàng lọc các chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase. Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của các chủng nấm phân lập. Đánh giá khả năng sinh laccase của chủng nấm phân lập. Khảo sát một số đặc tính của laccase tự nhiên.

Định danh vi sinh vật. TẠO DÒNG CÁC GEN MÃ HÓA LACCASE TỪ F. Khuếch đại các gen laccase từ cDNA của F. Tạo dòng các gen mã hóa enzyme laccase trong vector pGEM®T-Easy.

Giải trình tự gen laccase. BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA LACCASE TRONG Pichia pastoris. Tạo dòng cFolac1 vào pGEM®T-Easy và biến nạp vào E. Tạo dòng vào vector biểu hiện pPICZαA.

Tối ưu hóa sự biểu hiện laccase tái tổ hợp. Tinh sạch enzyme. Khảo sát đặc điểm enzyme tái tổ hợp. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP.

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH LACCASE. Môi trường nuôi cấy. Khảo sát một số đặc tính của laccase tự nhiên. PHÂN LẬP CÁC GEN MÃ HÓA LACCASE.

BIỂU HIỆN GEN FOLAC1 MÃ HÓA EMZYME TRONG NẤM MEN Pichia pastoris. Biểu hiện gen Folac1. Khảo sát đặc tính enzyme tái tổ hợp. Tối ưu hóa sự biểu hiện laccase tái tổ hợp.

THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP .106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.109 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .110 TÀI LIỆU THAM KHẢO .126 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả luận án Đặng Thị Thanh Hà iv LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Ngọc Lan và GS.

Nguyễn Hoàng Lộc, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế đã hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Đức Huy, Trưởng Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme và Protein, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế là giáo viên trực tiếp hướng dẫn, hỗ trợ kinh phí trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Trường Đại học khoa học, Đại học Huế.

Xin được gửi lời cảm ơn đến cán bộ và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Bộ môn Công nghệ sinh học, Bộ môn Sinh học ứng dụng, đã hướng dẫn tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu ở bộ môn. Tôi xin chân thành cảm ơn đến cán bộ và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme và Protein, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu ở Viện. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến GS. Seung- Moon Park và ThS.

Nguyễn Thị Mỹ Lệ, Đại học Quốc gia Chonbuk, Hàn Quốc đã hỗ trợ một số phân tích trong quá trình hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Tây Nguyên, cùng gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Thừa Thiên Huế, ngày ……tháng…….năm 2022 Nghiên cứu sinh Đặng Thị Thanh Hà v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 2,4- D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) Amp Ampicillin BPA Bisphenol A Bp Base pair BSM Bacteria Standard Medium CHCl3 Chloroform COD Chemical Oxygen Demand (Nhu cầu oxy hóa học) CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide DMP 2,6-dimethoxyphenol DNA Deoxyribonucleic acid DW Distilled water (Nước cất vô trùng) EC Enzyme commission EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EMS (Ethyl Methane Sulfonate) EP Eppendorf EtOH Ethanol Folac Gen laccase HBT Hydroxybenzotriazole vi HPI N- hydroxyphtaimide ITS Internal transcribed spacer (Vùng đệm được sao mã) IUB International Union of Biochemistry (Tổ chức sinh hóa quốc tế) LB Luria Bertani LiP Lignin peroxidase (ligninase) MnP Manganase peroxidase NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm DO Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Hoa Kỳ) PAH Dissolved Oxygen (Oxy hòa tan) PCB Polycyclic aromatic hydrocarbon PCI Polychlorinated biphenyl PCR Phenol: chloroform: isoamylalcohol PDA Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi Polymeras) PVA Potato Dextrose Agar RACE PCR Poly vinyl alcohol RBBR Rapid Amplification of ADNc-PCR SDS – PAGE Remazol Brilliant Blue R TAE Điện di gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide Taq Tris-acetate-EDTA TNT Thermus aquaticus vii UV 2,4,6-trinitrotoluen YP Ultraviolet (Tia tử ngoại) YPD Yeast peptone YPDS Yeast peptone dextrose YPM Yeast peptone dextrose sorbitol Yeast peptone methanol viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Ứng dụng của laccase trong phân hủy sinh học thuốc nhuộm.

Trình tự nucleotide các mồi dùng để khuếch đại gen Folac1, Folac2,. Trình tự các mồi dùng để khuếch đại gen cFolac1 từ cDNA. Trình tự các mồi dùng để khuếch đại gen AOX1F và AOX1R. Hàm lượng protein và hoạt tính laccase của 3 chủng F4, F5, F8.

Khả năng tích lũy laccase của chủng F4 ở 4 môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ khử màu thuốc nhuộm tổng hợp của laccase tái tổ hợp. Vai trò của chất trung gian đối với khả năng xử lí màu thuốc nhuộm của laccase tái tổ hợp .93 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc không gian của laccase từ Melanocarpus albomyces.

Trung tâm hoạt động của laccase được mô hình hóa. Cấu trúc trung tâm hoạt động của laccase [60]. Các kiểu xúc tác của laccase [10]. Quá trình oxy hóa ABTS thành dạng ABTS+ dưới sự xúc tác.

Hệ thống vector biểu hiện pPICZα A, B, C cho P. Cơ chế khử màu bằng enzyme và phân hủy thuốc nhuộm azo [79]. Khuẩn lạc 12 chủng nấm mốc phân lập được trên địa bàn Thừa Thiên Huế (F1-F12). Sàng lọc chủng sinh tổng hợp peroxidase trên môi trường chọn lọc có bổ sung guaiacol.

Khuẩn lạc sợi nấm chủng F4, F5, F8. Khả năng tích lũy laccase của chủng F5 ở 4 môi trường lên men. Khả năng tích lũy laccase của chủng F8 ở 4 môi trường lên men. Khả năng tích lũy laccase của chủng F4 sử dụng môi trường nuôi cấy MF3 ở các mức nhiệt độ khác nhau.

Khả năng tích lũy laccase của chủng F4 sử dụng môi trường nuôi cấy MF4 ở các mức nhiệt độ khác nhau. Khả năng tích lũy laccase của chủng F5 sử dụng môi trường nuôi cấy MF3 ở các mức nhiệt độ khác nhau. Khả năng tích lũy laccase của chủng F5 sử dụng môi trường nuôi cấy MF4 ở các mức nhiệt độ khác nhau. Khả năng tích lũy laccase của chủng F8 ở 3 mức nhiệt độ trong môi trường lên men MF3.

Khả năng tích lũy laccase của chủng F8 ở 3 mức nhiệt độ trong môi trường lên men MF4. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính laccase của chủng F4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính laccase của chủng F4. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính laccase F4.

Điện di đồ sản phẩm tách DNA tổng số chủng F4. Sản phẩm PCR trình tự ITS 1-4 chủng F4. Cây phả hệ di truyền loài của chủng F. oxysporum HUIB02 và một số loài Fusarium khác trên Genbank.

Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số từ F. Sản phẩm PCR khuếch đại các gen mã hóa laccase. Sản phẩm PCR gen Folac1 từ khuẩn lạc tái tổ hợp. Sản phẩm PCR gen Folac2 từ khuẩn lạc tái tổ hợp.

Sản phẩm PCR gen Folac3 từ khuẩn lạc tái tổ hợp. Sản phẩm PCR gen Folac4 từ khuẩn lạc tái tổ hợp. Sản phẩm cắt hạn chế bằng EcoRI plasmid tái tổ hợp pGEM®T-Easy- Folac1. Sản phẩm cắt hạn chế bằng EcoRI plasmid tái tổ hợp pGEM®T-Easy- Folac2.

Sản phẩm cắt hạn chế bằng EcoRI plasmid tái tổ hợp pGEM®T-Easy- Folac3. Sản phẩm cắt hạn chế bằng EcoRI plasmid tái tổ hợp pGEM®T- Easy- Folac4. Cây phả hệ di truyền gen Folac1 và một số gen laccase khác. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của Folac1 F.