Luận án: Sàng lọc thảo dược ức chế Xanthine Oxidase, giảm tạo thành acid uric - Đại học Cần Thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TỪ VĂN QUYỀN SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TỪ VĂN QUYỀN SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHÍNH PGS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG 2021 LỜI CẢM TẠ Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn PGS. Đái Thị Xuân Trang, PGS. Nguyễn Minh Chơn và PGS.

Nguyễn Trọng Tuân đã dành thời gian quý báu, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đức Độ, TS. Nguyễn Lộc Hiền, TS.

Huỳnh Kỳ, PGS. Nguyễn Thị Thu Nga cùng Quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn, khuyến khích và động viên tôi. Xin cảm ơn tất cả các bạn và các em trong phòng thí nghiệm Sinh - Hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa Sinh; phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Kính gởi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Tự nhiên, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo tiến sĩ.

Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn sâu sắc đến đồng nghiệp, gia đình và người thân đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành được luận án. Xin trân trọng cảm ơn tất cả. i TÓM TẮT Giới thiệu: Tăng acid uric không chỉ là nguyên nhân gây ra bệnh gout, mà còn làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và các hội chứng chuyển hóa. Acid uric được tạo ra do enzyme xanthine oxidase (XO) xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và oxy hoá xanthine thành acid uric.

Việc tìm ra các thảo dược và các hợp chất có nguồn gốc từ thảo dược có tác dụng ức chế enzyme XO đồng thời không gây tác dụng phụ là vấn đề hết sức cần thiết. Mục tiêu: (1) Phân lập được enzyme XO từ nguồn sữa bò của địa phương; (2) đánh giá được khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết 8 thảo dược; (3) phân lập được một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; (4) đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm. Phương pháp thực hiện: Phân lập enzyme XO được thực hiện theo phương pháp kết tủa enzyme bằng ammonium sulfate. Khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết các thảo dược được khảo sát bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 290 nm khi có và không có mẫu thử.

Phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược được thực hiện theo phương pháp chạy sắc ký cột hở. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đưa cao chiết vào cơ thể chuột qua đường uống, sau đó đo nồng độ acid uric trong máu chuột. Chuột được làm tăng acid uric trong máu bằng phương pháp tiêm kali oxonate vào màng bụng. Kết quả cho thấy, enzyme XO được phân lập từ sữa bò có hàm lượng protein là 0,509 mg/mg enzyme thô, enzyme sau khi được phân lập có hoạt tính và hoạt tính riêng lần lượt là 0,2095 U/mg enzyme thô và 0,412 U/mg protein.

Điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme XO đã phân lập được xác định ở pH 7,5; 25°C; 0,02 U/mL enzyme XO và 0,15 mM xanthine. Hiệu quả ức chế của allopurinol đối với hoạt tính của enzyme XO đã phân lập và enzyme thương mại là tương đương nhau. Cao ethanol nở ngày, húng chanh, dền gai ức chế enzyme XO yếu. Nồng độ ức chế 50% (IC50) enzyme XO của các cao ethanol cây sương sáo, râu mèo, kinh giới, nở ngày đất và cỏ xước lần lượt là 222±2,65; 143±4,04; 138±1,73; 42,5±2,99 và 17,5±0,1 µg/mL.

Chất đối chứng allopurinol có IC50 là 9,24±0,275 µg/mL. Năm hợp chất sạch đã được phân lập từ cao ethanol cỏ xước. Trong đó, hai hợp chất không có hoạt tính ức chế enzyme XO. Ba hợp chất còn lại đã được định danh là quercetin, quercitrin và hesperetin có tác dụng ức chế enzyme XO với IC50 lần lượt là ii 14,6; 37,7 và 103,2 µg/mL.

Hợp chất quercitrin ức chế enzyme XO theo kiểu hỗn hợp. Cao ethanol cỏ xước không có tác dụng làm thay đổi nồng độ acid uric trong máu chuột bình thường, làm giảm đáng kể nồng độ acid uric trong máu chuột bệnh (186±2,1; 129,4±15,2 và 128,7±31,9 µmol/L) và làm giảm hoạt tính enzyme XO trong gan chuột tăng acid uric (2,62±0,084; 1,79±0,127 và 1,87±0,075 mM acid uric /phút/g protein) tương ứng với các liều 150; 300 và 450 mg/kg. Nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO trong gan chuột bình thường lần lượt là 127,3±38,4 µmol/L và 3,11±0,033 mM acid uric/phút/g protein. Allopurinol có tác dụng làm hạ acid uric trong máu trên cả chuột bình thường và trên chuột bị tăng acid uric.

Kết luận: Từ các kết quả đạt được cho thấy, cao ethanol cỏ xước có tác dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric trong máu chuột bị tăng acid uric xuống mức bình thường. Cần có định hướng sử dụng cây cỏ xước trong phòng trị tăng acid uric trong máu. Từ khóa: acid uric, cỏ xước, quercitrin, xanthine oxidase iii ABSTRACT Introduction: The elevation of uric acid levels might be the main cause of not only gout but also cardiovascular diseases, kidney stones, diabetes and metabolic disorder. The formation of uric acid is often associated with the oxidation process catalyzed by xanthine oxidase enzyme (XO) in which hypoxanthine can be oxidized to xanthine and then uric acid.

The research and exploration of herbs and plant-related substances that perform a potential in inhibiting XO enzyme without causing any negative impacts are critical. The purpose of this study is to (1) extract XO enzyme from local cow’s milk; (2) evaluate XO enzyme inhibitory efficiency of extracts from 8 types of herbs; (3) extract a number of substances that are able to inhibit XO enzyme from potential herbs; (4) evaluate the effects of the extracts from potential herbs on serum-uric acid concentration of experimental mice. Methods: The extraction of XO enzyme was conducted followed by method using ammonium sulfate in order to precipitate enzyme. The inhibitory effect XO of the herbal was determined by spectroscopy at 290 nm.

The mixture reaction without sample was used as a blank control. The extraction of substances functionalizing in the XO enzyme inhibition from herbs was performed using a column chromatography. The investigation of impacts of extracts from potential herbs in serum-uric acid concentration was performed by giving mice extracts, and then measuring uric acid concentration in rat blood. Rats had increased uric acid in the blood by injecting potassiumoxonate into the peritoneum.

Results: XO enzyme extracted from cow’s milk contains 0.509 mg/mg of raw enzyme. The extracted enzyme activity and specific activity were calculated to be 0.412 U/mg protein, respectively. The optimal conditions for the activity of XO enzyme were determined at pH 7.02 U/mL enzyme and 0. The inhibitory efficiency of allopurinol versus the activity of the extracted XO enzyme and commercial enzyme was approximate.

The ethanol extracts of Gomphrena globosa, Plectranthus amboinicus, Amaranthus spinosus showed a low efficiency in the inhibition of XO enzyme. The half maximal inhibitory concentration (IC50) XO enzyme of ethanol extracts in terms of Mesona chinensis, Orthosiphon stamineus, Elsholtzia ciliata, Gomphrena celosiodes and Achyranthes aspera” were 222±2. The positive control allopurinol has the IC50 value of 9. Five compounds from ethanol extract of Achyranthes aspera were isolated.

Among iv them, two compounds did not exhibit an XO enzyme inhibitory activity. Three other compounds have been identified as quercetin, quercitrin and hesperetin indicated an effective activity in XO enzyme inhibition in which IC50 values are 14. Quercitrin compound inhibited XO enzyme according to mixed type. Achyranthes aspera ethanol-extract did not cause a change in serum-uric acid concentration in normal mouse but significantly reduced the serum-uric acid concentration in mouse model for hyperuricemia (186±2.9 µmol/L) and XO enzyme activity in increased-uric acid mouse liver corresponding to 150; 300 and 450 mg/kg treatments.

The uric acid concentration in blood and XO enzyme activity in normal mouse liver were 127.033 mM acid uric /min/g protein, respectively. The result illustrated that allopurinol had an effect on releasing serum-uric acid level in terms of either normal mouse or increased-uric acid mouse. In conclusion, Achyranthes aspera ethanol extract efficiently induced an inhibition on XO enzyme and reduced the serum-uric acid concentration in increased-uric acid mouse to a normal threshold. The use of Achyranthes aspera in preventing increased uric acid level in blood should be further investigated.

Keywords: Achyranthes aspera, uric acid, quercitrin, xanthine oxidase v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ. iv CAM KẾT KẾT QUẢ. vi MỤC LỤC. vii DANH SÁCH BẢNG .x DANH SÁCH HÌNH.

xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT. xiii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .1 Lý do chọn đề tài.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .1 Mục tiêu nghiên cứu .2 Nội dung nghiên cứu .3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .1 Đối tượng nghiên cứu .2 Phạm vi nghiên cứu.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .1 Thời gian nghiên cứu .2 Địa điểm nghiên cứu .5 Những đóng góp mới của đề tài .6 Ý nghĩa của luận án. 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme .2 Enzyme xanthine oxidase (E.2 Cơ chế hoạt động .3 Thông số động học của enzyme xanthine oxidase .4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme xanthine oxidase .5 Phân lập enzyme xanthine oxidase .3 Xanthine oxidase trong bệnh lý .1 Tăng acid uric máu và gout .2 Tăng acid uric máu và bệnh tim mạch, bệnh thận .4 Các phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase .1 Các phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase in vitro .1 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế xanthine oxidase in vitro bằng phương pháp quang phổ .2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang .2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất ức chế đến nồng độ acid uric trong cơ thể động vật .5 Các nghiên cứu xác định một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase.1 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase trên thế giới .2 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase ở Việt Nam.